角蛋白酶的高效表达及其在纳米银生物合成中的应用

发布时间：2020-05-18 14:31

【摘要】：角蛋白酶是一类可降解角蛋白的特殊蛋白酶,能作用于多种角蛋白底物,具有底物宽泛性,在医药、饲料、纺织等领域具有重要应用前景,其市场需求正在不断提升。但目前多数角蛋白酶的酶活、应用性能等还无法满足商业化应用要求,迫切需要挖掘更多优质角蛋白酶,并通过基因工程改造实现以角蛋白酶的高效表达及性能优化。为此,本研究从角蛋白酶基因挖掘、高效表达、热稳定性改造及其在银纳米粒子制备中的应用研究等方面开展了一系列工作。主要研究内容如下:(1)本论文首先从富含角蛋白的环境样品宏基因组DNA中挖掘获得一个角蛋白酶基因kerBv,该基因全长1149 bp,编码382个氨基酸。先将该基因在大肠杆菌中进行异源表达,目的蛋白为胞内酶,对宿主细胞伤害较大,非包涵体的活性表达酶活为40.9U/mL。枯草芽孢杆菌具有优秀的蛋白分泌能力,通过组装信号肽成功实现了重组角蛋白酶的胞外分泌表达,发酵液中最高酶活为164.8 U/m L。酶学特性研究显示,该角蛋白酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为10.0,并具有水解多种角蛋白的底物宽泛性。(2)为继续提升该重组角蛋白酶的表达水平和应用潜力,本研究采用启动子工程和培养基优化来实现枯草芽孢杆菌中重组角蛋白酶的高效表达。启动子是影响目的基因表达的关键因素,选择合适的启动子有助于实现重组蛋白的高效表达。本论文成功构建了携带16种不同启动子序列的角蛋白酶重组菌,7株重组菌产酶水平显著提升,其中PaprE启动子适配性改造重组菌的酶活水平最高,达到2605 U/m L,是对照菌酶活的20倍。以添加15 g/L甘油的TB培养基进行5 L发酵罐产酶研究,结果显示发酵至36 h时,发酵液中角蛋白酶活力高达7176 U/mL,是目前文献报道的重组角蛋白酶表达的最高水平,为角蛋白酶的实际应用奠定了基础。(3)角蛋白酶kerBv的热稳定性较差,其在60℃的半衰期为14.7 min。为提高重组角蛋白酶的热稳定性,利用理性设计策略寻找潜在的关键位点进行突变改造。构建角蛋白酶三维同源模型,在模型上选取了高柔性Loop区域中8个位点进行定点突变改造研究。对各重组酶突变体进行热稳定性评估,结果显示,N218S突变酶的热稳定性显著提高,其在60℃的半衰期延长至50.6 min,为初始酶半衰期的3.4倍。(4)角蛋白酶kerBv表现出较强的还原力,该还原力源于对角蛋白中二硫键的还原作用。在前期改造的基础上,本研究利用强还原力的角蛋白酶进行银纳米粒子的生物合成探究。经制备条件的系统优化,在1.0 mM AgNO_3浓度下,添加200 U角蛋白酶,反应48 h可制备出稳定的银纳米颗粒。该银纳米粒子颗粒完整、粒径范围为3-15 nm,在420 nm处有特征吸收峰,Zeta电位值为-22 mV。抑菌结果显示,100μg/m L银纳米粒子具有较好的抑菌活性。
【图文】：

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第一章绪论第一章绪论概述一种硬性纤维蛋白，在自然界中广泛存在，具有不溶性、强抗的差异，角蛋白可分为 α-角蛋白和 β-角蛋白（图 1-1）。羊毛、成，而羽毛则主要由 β-角蛋白构成[1-3]。由于分子中存在大量，角蛋白不溶于水，化学性质稳定，很难被普通蛋白酶所降解

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图 1-2 不同角蛋白酶水解胰岛素 B 链的切割位点Fig. 1-2 Cleavage sites of various keratinases as revealed by insulin B chain hydrolysis1.1.3 角蛋白酶的热稳定性研究角蛋白酶在实际应用中通常需要加热来加速反应，且角蛋白酶粉制备时的喷雾干燥过程也需要加热，因此，热稳定的角蛋白酶在实际应用中非常重要。提高酶热稳定性的方法包括添加保护剂、酶的化学修饰、固定化以及蛋白质工程改造等[29]。图 1-3 所示为提高酶热稳定性的蛋白质工程改造方法。基于蛋白质三维结构的定点突变改造是改变酶热稳定性的有效方法，近年来，建立在分子信息学基础上的蛋白质工程技术获得了长足的发展，基于蛋白质的晶体结构或同源模型，利用计算机辅助设计能对角蛋白酶进行半理性或理性的蛋白质工程改造，为提高角蛋白酶的热稳定性提供可行的技术手段。美国国立生物技术信息中心（NCBI）和蛋白质数据库（PDB）中存在角蛋白酶保守位点和蛋白质结构等信息，通过对信息的初步检索、分析以及进行计算机预测，确定热稳定性改造的潜在位点，进而构建突变体，进行体外实验验证，考察重组酶的表达情况及其热稳定性。对稳定性提高的突变体进一步计算分析以阐明其热稳定性提高的分子机制[30]，如
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q55;TB383.1

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