磁性纳米颗粒介导Oct4重编程HEK-293T细胞为iPSCs的研究
发布时间:2020-06-02 11:01
【摘要】:体细胞重编程生成诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)的策略因可以避免胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)存在的伦理争议而备受人们的关注。然而,iPSCs研究存在的效率低、耗时长和安全性差等问题限制了其在临床中的应用。鉴于此,本研究采用新型非病毒基因载体——聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(Polyethyleneimine coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPION-PEI)介导单个转录因子Oct 4的过表达,同时结合使用小分子物质3i即CHIR99021、PD0325901和A-83-01重编程HEK-293T细胞,旨在建立一种安全性好、生成效率高的iPSCs生成新方法。试验首先通过细胞毒性试验筛选出生物相容性良好的SPION-PEI作用浓度,确定SPION-PEI有效结合转录因子Oct 4的携载量以及SPION-PEI介导Oct 4进入HEK-293T细胞的可能机制,以便有效提高SPION-PEI携载Oct 4转染HEK-293T细胞的效率。然后,通过G418筛选出EGFP~+细胞克隆并扩增,结合小分子物质3i的处理以逆转化其获得iPSCs。应用该策略生成的iPSCs可以有效避免因病毒载体和致癌基因c-Myc、Klf 4介入而导致的潜在致瘤风险,加快iPSCs的临床应用进程。试验一:SPION-PEI对HEK-293T细胞毒性作用的研究为了筛选生物相容性良好的SPION-PEI的作用浓度,以进一步利用其作为非病毒载体有效携带转录因子Oct 4进入HEK-293T细胞过表达,为iPSCs的生成奠定基础,本研究采用不同浓度(10 ng/μl、50 ng/μl、100 ng/μl、200 ng/μl、400 ng/μl)的SPION或不同浓度(10 ng/μl、50 ng/μl、100 ng/μl、200ng/μl、400ng/μl)的SPION-PEI与HEK-293T细胞共孵育,通过比较各处理组细胞的贴壁生长形态变化、存活率、增殖毒性、氧化损伤、DNA损伤等的差异性,探讨SPION或SPION-PEI对HEK-293T细胞的毒性作用。结果表明:10 ng/μl的SPION-PEI处理组和10 ng/μl的SPION处理组间差异不显著(P0.05);其他相同浓度条件下SPION-PEI处理组对HEK-293T细胞的贴壁生长形态变化影响小于SPION处理组,对HEK-293T细胞的存活率、增殖毒性、氧化损伤、DNA损伤均低于SPION处理组。随着SPION或SPION-PEI处理浓度的增加,对HEK-293T细胞的贴壁生长形态变化、存活率、增殖毒性、氧化损伤、DNA损伤的影响随之增加。与对照组相比,浓度为10 ng/μl、50 ng/μl的SPION-PEI对HEK-293T细胞的贴壁生长形态变化、存活率、增殖毒性、氧化损伤、DNA损伤的影响差异不显著(P0.05)。因此,宜在小于50 ng/μl范围内筛选适宜浓度的SPION-PEI携载Oct 4转染HEK-293T细胞。试验二:SPION-PEI作为基因载体携带Oct 4进入HEK-293T细胞的条件优化通过SPION-PEI与Oct 4结合效率试验和DNaseⅠ保护试验,探究SPION-PEI对Oct 4质粒DNA的携载量及其对抗DNaseⅠ的保护作用。结果表明:当SPION-PEI与Oct 4质粒DNA的质量比为1:4时,Oct 4的结合效率达到97.13±0.24%,再增加SPION-PEI的量,结合效率几乎不再增加,表明该条件下两者的结合能力接近饱和;当SPION-PEI与Oct 4质粒DNA的质量比为1:1时,SPION-PEI与Oct 4质粒DNA完全结合,结合在SPION-PEI上的Oct 4质粒DNA,经DNaseⅠ消化、DNaseⅠ热失活、Oct 4洗脱后,琼脂糖凝胶条带的亮度与对照组基本相同,表明其酶切保护效率接近100%。通过比较存在外源磁场作用20min的条件下,不同浓度SPION-PEI/Oct4复合体对HEK-293T细胞转染效率的影响,结果表明SPION-PEI/Oct4复合体浓度为1.5 ng/μl时的细胞转染效率(76.47±2.82%)极显著高于其余各处理组(P0.01)。为探究SPION-PEI进入HEK-293T细胞的机制,以寻求进一步提高SPION-PEI介导Oct 4转染HEK-293T细胞效率的可能性,本试验通过在有外源磁场作用的条件下,比较不同浓度网格蛋白介导内吞作用抑制剂——氯丙嗪(Chlorpromazin,CPZ;浓度分别为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml)、小窝蛋白介导内吞作用抑制剂——制霉菌素(Nystatin;浓度分别为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml)、ATP生成抑制剂——2-脱氧-D-葡萄糖(2-Deoxy-D-Glucose,2-DG;浓度分别为1 mM、5 mM、10 mM、20 mM、40 mM)、巨胞饮作用抑制剂——阿米洛利(Amiloride;浓度分别为0.5 mM、1mM、2mM、4mM、8mM)、巨胞饮作用激活剂——佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA;浓度分别为50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)预处理30min对SPION-PEI/Oct4复合体转染HEK-293T细胞效率的影响。结果表明:CPZ各浓度处理组和制霉菌素各浓度处理组的细胞转染效率与对照组(76.47±2.82%)相比无显著性差异(P0.05)。1mM 2-DG处理组的转染效率极显著低于对照组(4.63±0.56%vs 76.47±2.82%,P0.01),当2-DG的作用浓度为10mM时,转染效率接近于0(0.3±0.58%)。1mM阿米洛利处理组转染效率极显著低于对照组(33.8±2.31%vs 76.47±2.82%,P0.01);随着阿米洛利浓度的增加,转染效率与1mM处理组相比差异不显著(P0.05)。50nM PMA处理组的转染效率与对照组比较差异不显著(76.29±2.04%vs 76.47±2.82%,P0.05);当PMA的浓度为100nM、200nM、400nM、800nM时,转染效率显著高于对照组(P0.05),其中PMA浓度为100nM时,转染效率最高,达83.44±2.16%。因此,宜采用SPION-PEI与Oct 4质粒DNA的质量比为1:1,SPION-PEI/Oct4复合体浓度为1.5ng/μl,外源磁场作用20min,添加100nM的PMA预处理30min提高SPION-PEI/Oct4复合物对HEK-293T细胞的转染效率。试验三:SPION-PEI介导Oct 4重编程HEK-293T细胞为iPSCs的可行性研究为了从基因载体和转录因子方面提高iPSCs的临床应用安全性,本试验采用非病毒基因载体SPION-PEI介导单个转录因子Oct 4过表达,同时联合使用小分子物质3i(CHIR99021、PD0325901和A-83-01),旨在避免致瘤基因如c-Myc、Klf 4导入的情况下诱导HEK-293T细胞逆转化生成iPSCs。通过形态学观察、碱性磷酸酶(Alkline phosphatase,AKP)染色、Oct-4和SSEA-3免疫细胞化学染色、拟胚体(Embryonic body,EB)生成和分化等指标对其多能性特征进行鉴定。结果表明:EGFP~+细胞克隆在使用3i培养基连续培养三周后,iPSCs样集落数达到78.23±8.46个;而使用未添加3i的普通干细胞培养基培养的EGFP~+细胞克隆,相同时间内未形成iPSCs样集落。Oct 4过表达结合小分子物质3i作用重编程HEK-293T细胞所得iPSCs样集落呈“岛屿”状,边界清晰、折光性强,高倍镜下可见细胞克隆的细胞核大而细胞质少,细胞间距非常紧密,形态上与ESCs相似。所挑选的iPSCs样集落经AKP染色呈红棕色,Oct-4和SSEA-3免疫细胞化学染色均呈红褐色,为阳性反应。分离得到的iPSCs样细胞悬浮培养5d后形成了简单的EB,7d后,形成显著的有腔EB,将形成的EB移至新的24孔板内,其贴壁生长7d后自发分化为神经上皮样细胞,EB贴壁分化的细胞中表达三个胚层的标志性基因:内胚层——甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)、中胚层——Brachyury、外胚层——α-1-抗胰蛋白酶(Alpha-1-antitrypsin,AAT)。表明所得iPSCs样细胞集落表现出一定的多能干细胞特性。因此,SPION-PEI介导单个转录因子Oct 4过表达,同时联合使用小分子物质3i的作用可以重编程HEK-293T细胞成为具有一定多能性特征的iPSCs。结论:50 ng/μl以下浓度SPION-PEI对HEK-293T细胞无明显毒性作用,在SPION-PEI与Oct 4质粒DNA的质量比为1:1,SPION-PEI/Oct4复合体浓度为1.5 ng/μl,外源磁场作用20min,添加100nM的PMA预处理30min的条件下进行HEK-293T细胞转染效果较好。SPION-PEI介导单个转录因子Oct 4在HEK-293T细胞内过表达,同时联合使用小分子物质CHIR99021、PD0325901和A-83-01,可以重编程HEK-293T细胞成为具有一定多能性特征的iPSCs。应用磁性纳米技术介导单个转录因子Oct 4过表达结合使用小分子物质重编程生成iPSCs的途径将为进一步提升其安全性,开展临床疾病诊疗和再生医学等领域的研究奠定基础。
【图文】:
素 O(Streptolysin O,SLO)可与细胞膜表面的胆固醇受体生寡聚化,形成环状的前孔(Pre-pore)结构,随后发生的膜中,最终在细胞膜上形成跨膜的大型双性 β-桶状孔道[11内传递大分子物质。但这种方式会导致靶细胞内一些生物大定的毒害作用。研究表明尺寸较小的 NMs,例如小尺寸的金如碳纳米管)[114]以及带正电的 NPs(如树枝状分子)可以方式被动进入细胞[116, 117],但是在穿透膜的过程中,会引起细胞内的离子、蛋白和其他大分子泄漏到膜外,,从而导致膜肽(Cell-penetrating peptide,CPP)可以穿透细胞膜且不 修饰的蛋白质[18]和金纳米颗粒[119]可以穿透细胞膜从而进粒表面交替覆盖带有阴离子的疏水配体蛋白后,可以在细胞膜[120]。
图 2 SPION 或 SPION-PEI 对 HEK-293T 细胞的形态学特征的影响A.HEK-293T 细胞培养 12h 的对照组;B.10 ng/μl SPION-PEI 处理组;C.50 ng/μl SPION-PEI 处理组;D.100 ng/μlSPION-PEI 处理组;E.200 ng/μl SPION-PEI 处理组;F.400 ng/μl SPION-PEI 处理组;G.HEK-293T 细胞培养 24h 的对照组;H.10 ng/μl SPION 处理组;I.50 ng/μl SPION 处理组;J.100 ng/μl SPION 处理组;K.200 ng/μl SPION 处理组;L.400 ng/μl SPION 处理组;(A-L 200×)Fig.2 Effects of SPION or SPION-PEI on the morphology characteristics of HEK-293T cellsA.Control group, HEK-293T cells cultured for 12h; B.10 ng/μl SPION-PEI treatment group; C.50 ng/μl SPION-PEItreatment group; D.100 ng/μl SPION-PEI treatment group; E.200 ng/μl SPION-PEI treatment group; F.400 ng/μl SPION-PEItreatment group; G. Control group, HEK-293T cells cultured for 24h; H. 10 ng/μl SPION treatment group; I.50 ng/μl SPIONtreatment group; J.100 ng/μl SPION treatment group; K.200 ng/μl SPION treatment group; L.400 ng/μl SPION treatmentgroup; (A-L 200×)3.1.2 CCK-8 检测由图 3 和图 4 的 CCK-8 检测结果可知:相同浓度下,SPION-PEI 或 SPION 作用于HEK-293T 细胞 24 h 后的细胞存活率,10 ng/μl、50 ng/μl 处理组差异不显著(P>0.05),其它各相同浓度处理组的差异显著(P<0.05)。不同浓度 SPION 作用于 HEK-293T 细胞24h 后,随着浓度的逐渐增加,细胞存活率逐渐降低,与 0 ng/μl 对照组相比,10 ng/μl、50 ng/μl处理组差异不显著(101.72 5.54% vs 100.6 1.3%,93.9 3.94%;P>0.05);100 ng/μl、
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R99;TB383.1
本文编号:2693058
【图文】:
素 O(Streptolysin O,SLO)可与细胞膜表面的胆固醇受体生寡聚化,形成环状的前孔(Pre-pore)结构,随后发生的膜中,最终在细胞膜上形成跨膜的大型双性 β-桶状孔道[11内传递大分子物质。但这种方式会导致靶细胞内一些生物大定的毒害作用。研究表明尺寸较小的 NMs,例如小尺寸的金如碳纳米管)[114]以及带正电的 NPs(如树枝状分子)可以方式被动进入细胞[116, 117],但是在穿透膜的过程中,会引起细胞内的离子、蛋白和其他大分子泄漏到膜外,,从而导致膜肽(Cell-penetrating peptide,CPP)可以穿透细胞膜且不 修饰的蛋白质[18]和金纳米颗粒[119]可以穿透细胞膜从而进粒表面交替覆盖带有阴离子的疏水配体蛋白后,可以在细胞膜[120]。
图 2 SPION 或 SPION-PEI 对 HEK-293T 细胞的形态学特征的影响A.HEK-293T 细胞培养 12h 的对照组;B.10 ng/μl SPION-PEI 处理组;C.50 ng/μl SPION-PEI 处理组;D.100 ng/μlSPION-PEI 处理组;E.200 ng/μl SPION-PEI 处理组;F.400 ng/μl SPION-PEI 处理组;G.HEK-293T 细胞培养 24h 的对照组;H.10 ng/μl SPION 处理组;I.50 ng/μl SPION 处理组;J.100 ng/μl SPION 处理组;K.200 ng/μl SPION 处理组;L.400 ng/μl SPION 处理组;(A-L 200×)Fig.2 Effects of SPION or SPION-PEI on the morphology characteristics of HEK-293T cellsA.Control group, HEK-293T cells cultured for 12h; B.10 ng/μl SPION-PEI treatment group; C.50 ng/μl SPION-PEItreatment group; D.100 ng/μl SPION-PEI treatment group; E.200 ng/μl SPION-PEI treatment group; F.400 ng/μl SPION-PEItreatment group; G. Control group, HEK-293T cells cultured for 24h; H. 10 ng/μl SPION treatment group; I.50 ng/μl SPIONtreatment group; J.100 ng/μl SPION treatment group; K.200 ng/μl SPION treatment group; L.400 ng/μl SPION treatmentgroup; (A-L 200×)3.1.2 CCK-8 检测由图 3 和图 4 的 CCK-8 检测结果可知:相同浓度下,SPION-PEI 或 SPION 作用于HEK-293T 细胞 24 h 后的细胞存活率,10 ng/μl、50 ng/μl 处理组差异不显著(P>0.05),其它各相同浓度处理组的差异显著(P<0.05)。不同浓度 SPION 作用于 HEK-293T 细胞24h 后,随着浓度的逐渐增加,细胞存活率逐渐降低,与 0 ng/μl 对照组相比,10 ng/μl、50 ng/μl处理组差异不显著(101.72 5.54% vs 100.6 1.3%,93.9 3.94%;P>0.05);100 ng/μl、
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R99;TB383.1
【参考文献】
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本文编号:2693058
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