单线态氧敏感的线粒体靶向纳米胶束用于光动力学抗癌疗法的研究

发布时间：2020-06-02 12:06

【摘要】：纳米技术已被广泛应用于光动力学疗法治疗各种疾病。光照、分子氧和光敏剂组成了光动力学疗法的三要素。激光照射时,光敏剂消耗氧气产生单线态氧。单线态氧是一种高活性自由基,可以破坏细胞内的各种成分如DNA、RNA、脂质和蛋白质等,进而诱发细胞凋亡或坏死,从而对肿瘤细胞产生杀伤作用。光动力学治疗由于其高效广泛的癌症治疗特性而被广泛应用。目前很多光敏剂已被开发或使用,例如血卟啉衍生物(第一代光敏剂);二氢卟吩类、卟啉类(第二代光敏剂);第二代光敏剂的衍生物(第三代光敏剂)。使用较多的光敏剂有二氢卟吩e6,脱镁叶绿酸a和焦脱镁叶绿酸a等。本课题中选择焦脱镁叶绿酸a(PPa)作为模型分子,是由于焦脱镁叶绿酸a有较高的单线态氧量子产率和可供高效化学修饰的分子结构,并且PPa的分子结构中只有一个-COOH的反应活性位点,因此可以较容易对其进行结构修饰并方便产物纯化。光动力学疗法有很多优点:1)微创,特异性高;2)副作用小,不会对正常细胞产生损伤;3)适应性好,不会给癌症患者带来化疗药物相关的不良反应如腹泻,呕吐,组织损伤等;4)有高度的选择性。然而,许多光敏剂都面临着水溶性差,血液循环时间短,疾病部位(如肿瘤)富集量少等问题。将光敏剂包载于纳米载体中是解决上述问题的一种有效方法。例如一些两亲性聚合物可以通过在水溶液中自组装形成纳米载体,进而提高疏水性药物的溶解度,延长其在体内的循环时间,提高药物的摄取量等。刺激响应型纳米载体具有靶向、控释等优点。根据刺激的不同类型可以分为内源性刺激(如pH,GSH,ROS,缺氧等)和外源性刺激(如光照、磁场、温度、超声等)。针对单线态氧响应的纳米载体,由于光敏剂产生单线态氧可以引起载体的溶解或者崩解,随后可以加速释放包载的光敏剂。因此,单线态氧响应的纳米载体凭借高应答性和按需释药特性而备受青睐。虽然刺激响应型纳米载体与光动力学治疗(PDT)的联合应用可以在一定程度上改善光敏剂水溶性差的问题,但是单线态氧的寿命较短(10-320 ns),扩散半径短("f20 nm)等因素极大的限制了PDT的治疗效率。因此,为了进一步提高PDT的治疗效率,光敏剂需要尽可能的定位于亚细胞器,如细胞核、线粒体和溶酶体中。众所周知,线粒体被称作“能量工厂”,是糖和脂肪等营养物质通过三羧酸循环,电子传递和氧化磷酸化等步骤生成ATP的场所,对细胞的存活起着极为重要的作用。大量研究表明线粒体的功能与细胞的凋亡密切相关。线粒体具有较高的负膜电位(150-180 mV),因此线粒体靶向分子一般具有以下两个特点:较高的正电性和较强的亲脂性。目前使用最多的线粒体靶向剂有三苯基膦,线粒体靶向肽和季胺盐等。本课题合成了一种单线态氧敏感纳米载体,其可以在光触发的状态下,通过膨胀,快速释放光敏剂。除此之外,还利用线粒体靶向TPP分子修饰光敏剂,使其具有线粒体靶向特性。三苯基阳离子(TPP)中磷原子上的正电荷可以离域到3个苯环上,促使TPP穿过磷脂膜,并在线粒体内膜中积累,达到线粒体靶向的目的。焦脱镁叶绿酸a是一种广泛使用的光敏剂,在经过三苯基阳离子修饰之后,可以包载于聚合物胶束的疏水内腔中。载药胶束在光照条件下迅速释放光敏剂,并且在线粒体部位累积,提高光动力学治疗效率。首先对光敏剂PPa进行结构修饰,利用PPa上的-COOH与三苯基膦小分子上的-NH_2发生酰胺化反应,得到具有线粒体靶向特性的焦脱镁叶绿酸a衍生物TPP-PPa。而后根据前人的方法经过三步合成~1O_2敏感载体mPEG-PAsp-IM。首先,为了验证PPa衍生物TPP-PPa被修饰之后的光敏特性,检测其单线态氧量子产率,结果发现,在有机溶剂二甲基亚砜(DMSO)中,PPa和TPP-PPa的单线态量子产率分别为0.48和0.38,说明PPa经过修饰之后在光照时可以产生单线态氧,证明TPP-PPa仍然保持良好的光敏特性。而后使用溶剂蒸发法制备载药胶束mPEG-PAsp-IM@TPP-PPa和mPEG-PAsp-IM@PPa,并对载药胶束进行表征。首先利用透射电镜(TEM)分析粒子形貌,观察带载药胶束成规则球形,无明显的聚集和黏连。在无光照条件下,mPEG-PAsp-IM@PPa载药胶束和mPEG-PAsp-IM@TPP-PPa载药胶束两的TEM粒径分别为132.8±18.5 nm和130.5±20.2 nm。同时在无光照条件下mPEG-PAsp-IM@PPa和mPEG-PAsp-IM@TPP-PPa两种胶束的水力学粒径分别为172.7±14.1 nm和176.3±12.3 nm。TEM测定的粒径比水力学粒径小40 nm左右,主要原因是TEM测定的粒径仅为疏水性内核部分,而水力学粒径还包括mPEG亲水外壳部分。为了进一步证明载体的~1O_2敏感特性,不同的光照条件用来处理纳米载体。光照1分钟和20分钟条件下,mPEG-PAsp-IM@TPP-PPa和mPEG-PAsp-IM@PPa两种胶束的粒径分别为337.3±33.6 nm(1分钟),758±59.7 nm(20分钟)和297.6±52.0 nm(1分钟),712.6±29.2 nm(20分钟)。光照20分钟之后的TEM结果可以看出胶束的粒径有明显增大,但是仍然呈规则球形,无聚集和黏连状态,进一步次证明了聚合物载体的单线态氧敏感特性。除了对胶束粒径和形态的观察之外,本课题还对载药胶束的药物释放特性进行研究,分别分析没有光照和光照10分钟条件下的药物释放曲线,结果表明mPEG-PAsp-IM@PPa载药胶束无光照时,36小时的累积释放量为19.6±1.5%,而光照10分钟后36小时的累积释放量为36.0±3.7%。同时mPEG-PAsp-IM@TPP-PPa载药胶束无光照时,36小时的累积释放量为27.3±1.6%,而光照10分钟后36小时的累积释放量为49.1±2.7%。两种载药胶束的药物累积释放曲线的结果证明光照处理可以促进药物的快速释放,验证了载药胶束的~1O_2敏感特性,与之前的粒径结果保持一致。本课题在细胞水平上对两种载药胶束的细胞毒性及线粒体靶向特性进行研究。利用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)方法检测各种样品的细胞毒性。首先载体mPEG-PAsp-IM和TPP-NH_2的细胞毒性结果表明,无论光照或不光照,载体均没有细胞毒性,因此载药胶束的细胞毒性完全来自于被包载的药物PPa和TPP-PPa。为了验证不同孵育时间对细胞存活程度的影响,细胞的孵育时间分别定为12小时和24小时。结果表明每组样品光照10分钟之后孵育时间越长,IC_(50)越小。孵育12小时之后,PPa,TPP-PPa,mPEG-PAsp-IM@PPa和mPEG-PAsp-IM@TPP-PPa的IC_(50)分别为2.7±0.1μM,1.4±0.1μM,3.5±0.2μM和2.1±0.2μM。孵育24小时之后各组样品的IC_(50)明显小于孵育12小时的结果,并且TPP-PPa组的IC_(50)值最小,mPEG-PAsp-IM@TPP-PPa载药胶束的IC_(50)次之。该结果表明线粒体靶向药物的细胞毒性的效果更好。此外,我们通过细胞摄取实验进一步考察光敏剂的细胞摄取效率和线粒体的靶向能力。结果表明4T1细胞加药孵育4小时之后,药物均可以被细胞很好的摄取,游离药TPP-PPa的细胞摄取效果更强,显示出较强的绿色荧光,一方面是由于小分子的简单扩散,另一方面是由于TPP-PPa带有正电荷可以与细胞膜的负电性发生静电相互作用,促进药物分子的摄取。使用线粒体荧光探针Mitotracker Deep Red考察线粒体靶向特性,使用Image J计算线粒体共定位参数,结果表明光照条件下,TPP-PPa的Pearson系数为0.891,Mander系数为0.938。这些结果均证明TPP-PPa具有很好的线粒体靶向特性,而PPa并不具有线粒体靶向特性。线粒体共定位能力依次为TPP-PPaTPP-PPa胶束PPaPPa胶束。此外本实验使用JC-1线粒体膜电位试剂盒检测线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时,JC-1可以产生红色荧光;在线粒体膜电位较低时,JC-1可以产生绿色荧光。实验过程中光照组作为实验组,未光照组作为对照组。结果表明,光照条件下,绿色荧光出现,而非光照条件下绿色荧光消失,红色荧光出现;非光照条件下只有明显的红色荧光出现。证明光敏剂光照条件下可以产生单线态氧破坏正常线粒体,使线粒体膜电位降低。细胞内ATP浓度的测定结果表明,光照条件下TPP-PPa组细胞内ATP浓度最低,说明在光照条件下细胞内线粒体受到严重损伤,影响了细胞内ATP的合成,所以TPP-PPa组的ATP浓度最低,该结果也与之前的细胞毒性实验结果和线粒体膜电位实验结果保持一致。实验中使用Caspase 9和Caspase 3活性检测试剂盒来检测两种半胱天冬酶的活性。结果表明,光照条件下TPP-PPa组Caspase 9和Caspase 3的活性均有明显升高,四组样品对Caspase活性影响能力依次为TPP-PPaTPP-PPa胶束PPaPPa胶束。说明TPP-PPa的促进细胞凋亡的能力最强,治疗癌症的效果最好,与之前的细胞内ATP浓度结果保持一致。利用Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒处理细胞之后,使用流式细胞计数仪来获得细胞凋亡结果。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒是用FITC标记的Annexin V作为探针,来检测细胞早期凋亡的发生。根据Annexin V与PI与细胞膜上蛋白的结合特点,可以用来区分早、中、晚期凋亡和坏死细胞。结果表明,光照条件下TPP-PPa组的细胞凋亡程度最强,所占比例大约有91.7%。证明了TPP-PPa的毒性最强,与细胞毒性结果保持一致。此外对照组(未加药物处理组)的坏死细胞所占比例大约为4.8%,该结果证明了激光照射对细胞的损伤程度较小甚至并无损伤,说明细胞的凋亡是由于光敏剂产生的单线态氧引起的。另外三组mPEG-PAsp-IM@TPP-PPa,PPa和mPEG-PAsp-IM@PPa的细胞凋亡程度依次为85.1%,80.6%,77.0%,和细胞毒性的结果保持一致。此外使用Calcein AM/PI双染细胞的方法分别对活细胞和死细胞进行染色并用激光共聚焦观察,结果显示未光照组细胞呈现绿色荧光(活细胞),而光照组细胞呈现不同程度的红色荧光(死细胞),该结果与细胞毒性结果也保持一致。综上所述,我们设计合成了一种多功能纳米胶束载药系统,该载药系统同时具有单线态氧敏感和线粒体靶向特性。单线态氧敏感载体mPEG-PAsp-IM中咪唑基团可以被单线态氧氧化生成亲水性的尿素,改变两亲性聚合物的亲疏水平衡,破坏胶束的稳定性,促使光敏剂快速释放。此外,线粒体靶向光敏剂TPP-PPa中阳离子的存在可以促使光敏剂穿越磷脂膜,并积聚在线粒体膜内。从而在光照条件下加速线粒体的损伤,导致细胞程序性死亡。单线态氧敏感特性和线粒体靶向特性的相互结合策略为基于自由基治疗癌症提供一个简便有效的方法。另外,此方法还为其它种类的光敏剂,声敏剂或者抗癌药物提供一个线粒体靶向思路,可以通过结构修饰,将药物与线粒体靶向剂结合赋予其线粒体靶向特性。
【图文】：

图SeFONL日SerO厂F
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R73-36;TB383.1

【相似文献】