新型银基纳米复合材料的抗菌性研究

发布时间：2020-06-11 19:14

【摘要】：抗生素滥用导致的细菌耐药性已成为威胁人类健康和安全的重大问题,新型抗菌剂的开发和应用成为人们关注的热点。银纳米颗粒(Silver nanoparticles,AgNPs)因具有广谱、高效、低耐药的抗菌特性,良好的生物相容性以及耐热加工的合成特点而备受青睐。但是银纳米颗粒的易团聚、易被氧化和易解离等缺点极大地限制了它在生物医学、纺织、水处理和涂料等领域的广泛应用。为了克服银纳米颗粒的缺点,本论文设计和制备了两种新型银基纳米复合材料,分别为氧化石墨烯-纳米银复合物(Graphene oxide-silver nanoparticles,GO-AgNPs)和Y型DNA-银纳米簇复合物(Y-DNA-silver nanoclusters,Y-AgNCs),并系统研究了它们的物理化学性质、抗菌性、生物相容性以及在伤口愈合中的应用。主要研究内容及成果概述如下:(1)GO-AgNPs复合材料和GO-AgNPs基底的制备与表征。我们采用改良的Hummers方法,制备出水分散性良好的氧化石墨烯(GO)悬液,原子力显微成像显示GO为单片层,厚度约1 nm,大小为几百纳米到3μm之间。然后,我们以硼氢化钠为还原剂,通过原位化学还原法合成GO-AgNPs,透射电镜显微成像显示GO-AgNPs中AgNPs的平均粒径为7.06±2.54 nm。最后,我们采用滴涂法在玻璃表面修饰一层GO-AgNPs薄膜。通过调节GO-AgNPs浓度,得到表面GO-AgNPs吸附量不同的系列玻璃基底。(2)氧化石墨烯-纳米银复合物对菌膜形成和结构的调控。我们选择绿脓杆菌作为研究对象,研究了GO-AgNPs悬液对菌膜生长和结构的影响。在12 h内,GO-AgNPs悬液对绿脓杆菌菌膜形成的抑制效应具有浓度依赖性:GO-AgNPs悬液的浓度越高,菌膜越难形成;浓度为25μg/mL时,GO-AgNPs悬液会彻底抑制菌膜的形成。而且,GO-AgNPs悬液的抗菌膜效果优于单独的GO或AgNPs,这种优异的抗菌性源自复合材料两种组分的协同作用。此外,GO-AgNPs悬液对菌膜生长动力学的影响存在一个临界值15μg/mL。低于临界浓度,GO-AgNPs悬液延缓菌膜生长,菌膜生长24 h到达成熟期;高于此浓度,GO-AgNPs悬液彻底抑制菌膜形成。同时,我们发现低浓度的GO-AgNPs悬液几乎不影响成熟期菌膜的总生物量,但影响菌膜的结构组成,即显著降低细菌增殖却促进细菌分泌更多的胞外多聚物(Extracellular polymeric substance,EPS)。这些研究成果为调节菌膜形成和结构提供了一种简单方法,也为防止菌膜诱发细菌感染或更好地利用菌膜治理污水等应用提供了新思路。(3)氧化石墨烯-纳米银复合物基底的抗菌膜研究。绿脓杆菌与GO-AgNPs基底共孵育2 h,涂板计数显示GO-AgNPs基底通过杀死细菌的方式降低粘附于基底的细菌数目,进而抑制菌膜形成。基底表面GO-AgNPs吸附量直接影响菌膜形成;吸附量越高,菌膜越难形成;当GO-AgNPs吸附量达到20μg/cm~2时,可以有效地防止菌膜生成。同时,我们发现GO-AgNPs基底不会影响小鼠前成骨细胞的生长和分化,也未引发溶血,显示了良好的生物相容性。这说明GO-AgNPs可作为临床植入器件的涂层,防止常规植入材料易引发的细菌感染。(4)Y-AgNCs纳米结构及其水凝胶的制备和表征。基于DNA分子的可编程和精确自组装特性,我们构建了富含胞嘧啶(Cytosine,C)环和粘性末端的Y型DNA纳米结构(Y-DNA)。由于银离子(Ag~+)与C碱基之间的高亲和力,我们通过氧化还原法在Y-DNA的C环处原位合成银纳米簇(Silver nanoclusters,AgNCs),形成Y-AgNCs。UV-Vis光谱显示Y-AgNCs在408 nm处存在AgNCs的特征紫外吸收峰;荧光分析表明此结构具有红色荧光,激发/发射光波长分别为565 nm/631 nm。Y-DNA的粘性末端和与其互补的双链DNA交联形成DNA-AgNCs水凝胶。流变分析发现250μM的DNA-AgNCs水凝胶的储存模量(G’)大于损耗模量(G’’),符合水凝胶的特性。扫描电镜成像观察其有典型的水凝胶三维网状结构。(5)Y-AgNCs纳米结构及其水凝胶的生物效应研究。Y-AgNCs对革兰氏阴性菌(大肠杆菌Escherichia coli)和阳性菌(枯草杆菌Bacillus subtilis)均有很好的抗菌性;其浓度为200 nM时,抗菌率接近100%。此外,Y-AgNCs对小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)无明显的细胞毒性。在细菌与细胞共培养实验中,Y-AgNCs依然维持了优异的抗菌性和良好的生物相容性。此外,Y-AgNCs能有效促进小鼠伤口愈合,可作为潜在的伤口愈合喷雾。DNA-AgNCs水凝胶保持了Y-AgNCs的广谱抗菌性,可显著杀灭覆盖于其表面或包裹在其中的革兰氏阴性菌和阳性菌;当Y-AgNCs浓度为200 nM时,水凝胶对两种细菌的抗菌率均接近100%。DNA-AgNCs水凝胶亦可作为细胞培养基质,细胞在水凝胶内呈三维空间分布,且生长良好。因此,DNA-AgNCs水凝胶在组织工程方面显示出极大的应用潜力。总之,在本论文中我们制备了两种新型银基纳米抗菌材料GO-AgNPs和Y-AgNCs,二者均显示出优异的抗菌性和良好的生物相容性,在生物医学领域具有广阔的应用前景。同时,两种纳米复合材料的研究也拓宽了制备和应用银基纳米抗菌材料的思路,为银基材料更广泛地使用提供了有价值的理论基础。
【图文】：

抗菌材料,人类,抗菌活性,纳米银

图 1.1 人类利用银基抗菌材料的历史[31]。我们知道纳米材料的生物效应往往与其尺寸相关，AgNPs 的抗菌性也不例外。 Duran 等[34]的研究发现，当 AgNPs 粒径低于 10 nm 时，AgNPs 的抗菌活性主要归因于粒子本身。但随着 AgNPs 大小逐渐增加时，抗菌活性主要来自AgNPs 释放的 Ag+。而且，与银离子相比，小颗粒的 AgNPs 能够更容易地进入微生物细胞。AgNPs 通过诱导细胞膜损伤和活性氧化物（ROS）反应，最终破坏细胞的 DNA，在抗菌上，比银离子更有优势[35,36]。除了尺寸大小，AgNPs 的形状也会影响 AgNPs 的抗菌活性。Pal 等[37]研究了不同形状纳米银的抗菌性能，发现三角形状的纳米银抗菌性能优于棒状纳米银。此外，Xiu 等[38]发现在酸性和有氧条件下，AgNPs 能更加快速地释放银离子，从而增加抗菌活性。Wirth等[39]发现带有 AgNPs 涂层的玻璃表面能有效阻碍绿脓杆菌的着落和增殖。Yoon等[40]发现 AgNPs 对大肠杆菌的抗菌能力要低于枯草芽孢杆菌，这或许归因于大

氟康唑,抗菌活性,纳米金,庆大霉素

早在十九世纪，金这种珍贵的金属被发现可用于治疗梅毒，到 20 世纪20 年代时，Aremu 等发现氰化金可以抑制结核分歧杆菌[42]。随着纳米技术的发展，人们利用多种方法，如热分解、多元醇合成法、电化学合成法和化学合成法等，成功制备出纳米金（AuNPs）。Piruthiviraj 等[43]利用甘蓝合成出 AuNPs，，发现该 AuNPs 对革兰氏阴性菌/阳性菌和真菌的抗菌活性高于典型的抗生素氟康唑和庆大霉素（图 1.2）。Kojic等[44]发现辐照能增强 AuNPs 对金黄色葡萄球菌的杀灭活性。此外，Guo 等人[45]利用红外照射 AuNPs 水溶液，发现 AuNPs 能有效破坏溶液中的脂质体，间接说明 AuNPs 的抗菌活性可能源自其对细胞膜脂质体的破坏。此外，除了利用单独的 AuNPs 进行抗菌，还可以将 AuNPs 与其他抗菌剂（如抗生素和抗菌肽）结合，实现协同增强抗菌。Shaker 等[46]将碳青霉烯（亚胺培南和美罗培南）与柠檬酸盐覆盖的 Au 纳米颗粒结合，实现药物在 48 小时内的持续释放和长效抗菌。
【学位授予单位】：上海大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TB33

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