基于羟基磷灰石纳米晶功能材料的制备及其在骨组织工程中的应用

发布时间：2020-07-13 04:17

【摘要】：羟基磷灰石(Hydroxyapatite:HAp)是人体骨骼和牙齿中主要的无机成分。相比于其他骨组织修复材料,HAp基生物材料能够更好地诱导骨组织再生和修复,并且几乎不会引起任何副作用,因此在骨组织工程中得到广泛地应用。纳米材料独特的优势,如多的表面缺陷,大的比表面积以及其他独特的物理性能,拓展了材料在组织工程领域中的应用。相比于块体状态,纳米磷酸钙材料对细胞的粘附、增殖、分化以及骨组织愈合都具有更好的促进作用。因此,HAp纳米晶结构的调控对于HAp基生物材料在组织工程中的应用起到非常重要的作用。虽然HAp纳米晶形貌的调控和性能的优化已经得到广泛地研究,但仍需进一步探索以满足特定的应用需求。通过荧光可视化细胞的行为,对于在骨组织工程中研究修复材料与细胞的相互作用是非常重要的。此外,材料的纳米结构对细胞行为具有明显的影响。因此,制备具有优异荧光性能的纳米HAp以可视化细胞行为,以及制备具有合理结构的纳米HAp并依靠纳米结构的作用促进干细胞成骨分化,在骨组织工程中具有重要的意义。随着人们对组织修复不断提高的要求,传统的单一材料通常难以满足修复过程中的实际需求。复合材料往往具有两种或多种材料的综合优势,能够达到最优化的、目的性的组织修复。因此,复合材料成为目前组织工程领域的研究热点。通过对纳米HAp复合材料进行结构设计和性能优化,能够赋予HAp更多的功能,以充分的满足复杂环境中组织修复的特定需求。传统的HAp复合材料往往只是将几种材料简单的机械混合,丧失了获得最佳性能的可能,从而无法充分发挥材料应有的优势。因此,通过合理的结构设计,使HAp复合材料具有更完备的功能,对于实现骨组织的精确修复和特殊性修复具有重要的意义。基于以上问题,本论文旨在以HAp为研究对象,通过对材料组成与结构的设计,以及对材料/细胞相互作用的深入理解,合成具有不同组成和形貌的纳米HAp,从而研究组成、结构及表界面状态对细胞的影响以实现不同的生物应用;同时,基于材料功能设计,通过组装第二类材料,构建多功能化纳米HAp复合材料,从而拓展HAp纳米材料的应用。本论文主要包括以下四个方面的工作:(1)HAp荧光纳米棒对细胞可视化成像及高效药物传递通过溶剂热法制备了具有优异荧光性能的铕(europium)/铽(terbium)双掺氟化HAp(Eu/Tb FAp)纳米棒和碳量子点-HAp(CQD-HAp)复合纳米棒,并对两类不同发光机制的HAp基荧光纳米棒的合成及其与细胞的相互作用进行了研究。首先,利用双掺杂稀土离子的协同作用,实现了 Eu/Tb FAp纳米棒在单波长激发下的双波长发射,并可对双波长发光强度进行调控。Eu/Tb FAp纳米棒具有均一的形貌,长度大约为200 nm。氟化能够提高Eu/Tb FAp的荧光强度。通过Tb3+离子和Eu3+离子之间的部分能量转移,Eu/Tb FAp纳米棒在单一波长488 nm激发下同时发射绿色荧光和红色荧光,通过接收不同的波段可以对细胞进行双色荧光标记,以便于在复杂环境中标记和追踪细胞,并且可以通过荧光可视化观察细胞对纳米棒的内吞作用。由于FAp的降解速率低,因此合成了稀土-氨基酸荧光纳米晶用来验证稀土元素Eu和Tb对细胞的安全性。结果表明,稀土元素(Tb和Eu)对细胞的毒性很低。因此,Eu/Tb FAp纳米棒在降解后对细胞不会产生明显的副作用,从而进一步证明了 Eu/Tb FAp纳米棒高的生物安全性。其次,利用碳量子点的荧光性能和HAp纳米棒的携带键和作用,合成了CQD-HAp复合纳米棒。CQD-HAp复合纳米棒长度约为100 nm,宽度约为15 nm。CQDs表面与发光性能密切相关的官能团和HAp通过配合键形式结合,使CQDs在细胞内受到一定程度的保护,从而使CQD-HAp复合纳米棒具有比CQDs更长的荧光寿命。复合纳米棒表面具有大量介孔,对阿霉素(Dox)有强的吸附能力,可作为良好的药物载体。相比于当量浓度的纯Dox,Dox-CQD-HAp复合纳米棒对HeLa细胞具有更强的致死性。优异的荧光性能拓展了 HAp纳米棒在细胞成像,标记追踪,内吞作用可视化观察,药物传递和释放可视化观察等方面的应用,对探究细胞行为以及细胞和纳米材料的相互作用具有重要的意义。(2)长度可调一维HAp纳米晶构建纳米地貌调控干细胞成骨分化调节溶剂比例,通过溶剂热法制备了长度可调的一维(1D)HAp纳米晶,探究了不同纳米结构形成的衬底地貌对干细胞成骨分化的影响。在相同的反应体系中,溶剂比例(乙醇/水)可以调控1D HAp纳米晶的长度。所制备的1D HAp纳米结构具有相同的表面性质和结晶生长方向,这为单一化研究纳米结构对干细胞行为的影响提供了保障。不同的1D HAp纳米结构对细胞的形貌,粘附,伸展和伪足状态具有不同的影响,甚至对细胞活性也具有明显的调控作用。细胞在短纳米线(5μm)和纳米棒(100 nm)衬底上具有良好的活性,而在长HAp纳米线(50μm)衬底上,细胞活性明显的降低。且在无诱导因子的条件下,短纳米线能够明显成骨相关基因和蛋白的表达。因此,HAp短纳米线涂层仅仅通过结构的作用就能够有效地促进干细胞的成骨分化。此外,HAp纳米棒涂层只能较低程度地促进干细胞的成骨分化。这种不引入生长因子只依赖纳米结构调控干细胞成骨分化的方式对干细胞工程和骨组织工程都具有重要的意义,也对于其他生物材料表面涂层的设计具有一定的指导意义。(3)HAp纳米线/聚乳酸双面神膜:骨诱导再生/屏障双功能用于骨组织精确修复通过合理的结构设计,利用一种简单高效的方法制备了具有骨诱导再生和屏障双功能的HAp纳米线/聚乳酸(HAp/PLA)双面神膜,其目的是克服生物材料在骨修复过程中骨诱导再生和周围组织粘连的矛盾。首先制备长度约为20μm的HAp纳米线,通过抽滤制备成HAp纳米线纸。然后利用扩散-蒸发自成膜的方法制备具有两面不同材料的HAp/PLA复合膜。利用HAp的亲水性和PLA的疏水性,赋予HAp/PLA双面神膜两面两种不同的性质:亲水HAp面能够促进细胞的粘附、生长和成骨分化,而疏水PLA面能够阻止细胞的粘附和生长。CCK-8细胞活性检测和活/死细胞染色结果表明,细胞仅在双面神膜HAp面生长和粘附,并且HAp面能够有效地促进干细胞的成骨分化;而在PLA面,细胞无法粘附和生长,从而起到屏障的作用。q-PCR结果证明双面神膜HAp面能够促进成骨相关基因的表达。ALP测试结果和免疫荧光染色结果证明HAp面能够促进成骨相关蛋白的表达。体内实验证明,HAp/PLA双面神膜的HAp面能够有效地诱导骨再生,而PLA面能够阻止新生骨和周围软组织之间的术后黏连。HAp/PLA双面神复合膜既能够阻止组织修复后的术后黏连,又能够有效的促进骨再生,并且制备流程简单,成本低,易于实际的推广和应用。因此,结构优化的HAp/PLA双面神膜将会在骨组织的精确修复中起到积极地促进和指导作用。(4)HAp纳米线/聚乳酸双面神膜负载铜-半胱氨酸纳米颗粒用于骨癌术后组织修复通过金属-氨基酸配合作用,大规模制备了铜-半胱氨酸纳米颗粒(Cu-Cys NPs)。Cu-Cys NPs组成为人体所需的氨基酸和铜离子,因此降解之后对身体不会引起明显的副作用。被细胞摄取后,Cu-Cys NPs先和细胞内GSH发生反应,产生Cu+;然后Cu+再和H2O2发生类芬顿反应产生具有强攻击性的羟基自由基(.OH),从而引起癌细胞的凋亡。Cu-Cys NPs和胞内的GSH、H2O2发生级联化学动力学反应,既能够消耗还原物质GSH,又能产生·OH,使得Cu-Cys NPs对癌细胞具有高的致死性。此外,动物实验结果证明,Cu-Cys NPs能有效抑制耐药性肿瘤的生长,并且不会引起体内的系统性毒性。将Cu-Cys NPs负载于HAp纳米线上,按照双面神膜的制备流程,获得Cu-Cys NPs/HAp/PLA多功能性复合膜。复合膜的Cu-Cys NPs/HAp面对癌细胞仍然具有高的致死性。因此,复合膜既可以精确修复骨癌术后引起的骨缺损,同时又可以杀死可能残留的癌细胞,抑制癌症复发。因此,Cu-Cys NPs/HAp/PLA多功能性复合膜将会在骨癌引起的组织缺陷修复中具有巨大的潜力,同时也为其他癌症引起的组织缺损的修复起到一定的导向作用。综上所述,本论文制备了结构和性能优化的HAp纳米晶以及基于HAp纳米晶的新型复合材料,并对材料的性能和应用进行了深入的研究。荧光HAp纳米棒能够可视化内吞过程以及药物的传递和释放,以观察纳米颗粒和细胞的相互作用。不同长度1D HAp构建的纳米地貌能够在无诱导因子辅助下显著地促进干细胞的成骨分化,为HAp材料在骨组织工程中的实际应用提供了巨大的便利。结构设计合理的、具有骨诱导再生/屏障双功能的HAp/PLA双面神膜为骨组织的精确修复提供新的解决方案。此外,将新型抗癌纳米制剂Cu-Cys NPs负载于HAp纳米线上,在双面神膜基础上获得Cu-Cys NPs/HAp/PLA多功能性复合膜,以应用于骨癌术后引起的骨组织缺陷修复。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TB34;R318.08
【图文】：

进行评价的重要参考依据。因此，骨组织修复材料对干细胞行为尤其是成骨分逡逑化的影响，是评价材料促进骨再生和修复的一项重要标准。逡逑干细胞对材料的各种响应（图１－１），如细胞的粘附，伸展，迁移等行为，逡逑是分析材料－细胞复合系统的重要参考因素［７７－７９］。干细胞的粘附和迁移状态对逡逑其定向分化具有重要的调控作用。细胞行为的分析，不仅可以用来研究干细胞逡逑和材料的相互作用，同时也为干细胞外特定微环境构建以及体内组织修复提供逡逑了论证和基础。逡逑Ｍａｔｒｉｘ邋＼邋＼逡逑ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ邋＼＼逡逑．＼逡逑＾逦Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｎｉｃｈｅ邋ｓｉｇｎａｌｓ逡逑Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ逡逑ｆｏｒｃｅｓ逦ｊ逦Ｃｅｌｌ逡逑Ａｌｔｅｒｅｄ邋ｇｅｎｅ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ逡逑／邋ｉ邋＼逡逑Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ邋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ逦Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ逡逑图１－１细胞对材料的响应［７９］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｐｏｎｓｅ邋ｏｆ邋ｃｅｌｌｓ邋ｔｏ邋ｍａｔｅｒｉａｌ逡逑细胞粘附和迁移是贴壁细胞进行一切后续行为的基础。所有的组织修复逡逑（包括骨组织修复）过程中，细胞在体内的徖移对组织的修复是至关重要。当逡逑组织发生受损时，只有足够数量的千细胞和其他所需功能性细胞聚集到损伤处，逡逑才能够对受损的组织和器官进行有效的修复。针对于此，通过荧光纳米材料可逡逑视化追踪细胞得到了广泛的研究。荧光纳米材料可视化追踪，可以方便的观察逡逑到细胞迁移和募集的过程

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逦Ｔｉ邋ｉｍｐｌａｎｔ逡逑图１－４磷酸钙材料和细胞的相互作用［９２］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｔｈｅ邋ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｃａｌｃｉｕｍ邋ｐｈｏｓｐｈａｔｅ邋ｍａｔｅｒｉａｌｓ邋ａｎｄ邋ｃｅｌｌｓ逡逑磷酸钙骨组织修复材料由于具有良好的骨诱导性，人体自洽性，低免疫性，逡逑可降解性等优势，在骨组织工程中得到广泛地应用。磷酸钙纳米颗粒，磷酸钙逡逑陶瓷，磷酸钙多孔支架，以及a愃岣疲�有机材料复合支架等基于磷酸钙的不同类逡逑型的骨修复材料已经得到广泛的研究。不同类型的磷酸钙材料在骨组织工程中逡逑具有不同的应�

本文编号：2752946