活性氧自由基敏感和线粒体靶向的纳米颗粒在肺癌诊疗中的应用

发布时间：2020-07-16 19:19

【摘要】：线粒体是有氧呼吸的关键细胞器和细胞动力的来源。线粒体中相关蛋白参与了细胞凋亡信号通路并且它参与的凋亡信号通路被认为是癌症治疗中的主要细胞死亡模式。线粒体功能紊乱与肿瘤发生发展有多方面关系。肿瘤细胞的线粒体和正常细胞的线粒体有很大不同。大多数肿瘤细胞的线粒体膜电位(ΔΨm)高于正常细胞,有利于肿瘤细胞对阳离子药物和阳离子修饰的纳米颗粒的选择性摄取,而一种靶向线粒体的策略就是利用亲脂性阳离子。单线态氧(~1O_2)是一种活性氧自由基(ROS),在光动力治疗中,光敏剂产生的单线态氧起杀伤细胞的作用。由于单线态氧在生物体中半衰期短(0.1 ms),扩散半径小(20 nm),光敏剂在空间上应接近光动力治疗的作用部位。线粒体是有氧呼吸的关键细胞器和细胞内固有ROS的来源,高达90%的固有ROS来源于线粒体。因此,负载光敏剂的线粒体靶向的纳米体系可干扰ROS稳态并进一步诱导细胞凋亡,进而提高光动力治疗效率。与正常细胞相比,癌细胞有更大的ROS氧化压力。正常细胞在较低的ROS氧化压力下具有更多的能力来应付额外产生的ROS。因此,对肿瘤微环境中所有细胞的ROS量进行一定幅度的提升可用于癌细胞的选择性杀伤。为了获得更好的治疗效果,同时避免副作用,多种响应型的纳米体系被开发用来递送药物。各种响应方法,如pH敏感,氧化还原敏感,温度敏感,酶敏感和光响应等,已被用于控制药物释放。然而,很少有人报道ROS响应的药物控制释放,尤其更少有人报道近红外光触发的ROS响应的药物释放。因此,本论文制备了三种新的纳米药物递送系统,对它们进行了ROS敏感性或线粒体靶向性的修饰。主要研究内容如下:(一)设计并制备了一种新型的980 nm激光激发的ROS敏感的上转换纳米体系用于肺癌的化疗和光动力治疗的联合治疗。合成了ROS敏感的缩硫酮linker,将此linker与喜树碱CPT相连形成喜树碱前药,ROS可切割缩硫酮linker释放喜树碱。而激光刺激光敏剂产生ROS切割缩硫酮linker的研究很少。上转换纳米颗粒(UCNPs)表面以喜树碱前药,光敏剂二氢卟吩e6(Ce6)和含羧基的聚乙二醇修饰。在980 nm激光的照射下,修饰后的UCNPs在645-675 nm有荧光发出,Ce6可吸收此光产生ROS,ROS可用于光动力治疗,也可切割缩硫酮linker释放喜树碱用于化疗,喜树碱的释放是激光控制的定时定点的药物释放,同时,Ce6吸收此光发射出的光可用于荧光成像。实验结果表明,该ROS敏感的上转换纳米体系可很好的靶向原位肺癌;在980 nm激光的照射下,化疗和光动力治疗联合治疗可以将NCI-H460移植瘤完全根除。(二)设计并制备了一种新型的线粒体靶向ROS敏感的复合纳米胶束用于肺癌的化疗和光动力治疗。ROS敏感线粒体靶向的嵌段聚合物TL-CPT-PEG_(1K)-TPP与DSPE-PEG包裹光敏剂酞菁锌ZnPc形成复合纳米胶束。亲脂性的阳离子三苯基膦很容易穿透带负电荷的细胞膜和线粒体膜,使其积累在线粒体部位的浓度是细胞其它部位的数百倍。缩硫酮linker是ROS敏感的,ROS可切割linker释放CPT。在此纳米体系中,ZnPc吸收633 nm激光产生ROS,ROS可用于光动力治疗,同时ROS也可切割缩硫酮linker释放CPT用于化疗。此纳米体系是线粒体靶向的,这更增加了线粒体中ROS的量并诱导细胞凋亡。因此,此复合纳米胶束体系为肺癌的化疗和光动力治疗的联合治疗提供了一种新的选择。(三)设计并制备了一种线粒体靶向的温敏脂质体用于肺癌的化疗,热疗和光动力治疗的联合治疗和荧光成像。DSPE-PEG2000-NH_2与三苯基膦通过偶联形成DSPE-PEG_(2K)-TPP。该脂质体是由DPPC,DSPC,DSPE-PEG_(2K)-TPP,胆固醇,IR-780和Lonidamine通过自组装得到。当脂质体在三苯基膦的带领下进入到线粒体后,808 nm激光使光敏剂IR-780产热,提高局部温度可用于热疗,升高的温度可诱导Lonidamine从温敏脂质体中释放用于化疗。同时,IR-780在激光的照射下可产生ROS用于光动力治疗。因脂质体定位在线粒体中,其光动力治疗效率进一步提高。另外,此脂质体可用于近红外荧光成像。脂质体具有良好的生物相容性,未负载药物的空脂质体的组成成分很安全,完全可用于人类。很少有IR-780用于光动力治疗的报道,本课题再一次证明了IR-780可用于光动力治疗。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2;TB383.1;R730.5
【图文】：

线粒体,有氧呼吸,能量,粒体

图 1-1 线粒体的结构Fig.1-1 structure of mitochondrion线粒体是细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，它可以过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷（ATP），被称为"动力工厂"。除了参与氧化磷酸外，线粒体也维持钙离子水平，应对氧化压力，同时线粒体在细胞凋亡中扮演重要角色。线粒体是直接利用 O2制造能量的部位，90%以上吸入人体的 O2被粒体消耗掉。但是，O2是个“双刃剑”，一方面生物体利用 O2制造能量，另一面 O2在被利用的过程中会产生活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）伤生物体并造成氧毒性。线粒体的损伤主要与 ROS 的产生量有关，线粒体损超过一定限度，细胞就会衰老死亡。线粒体中的蛋白质、脂质、氧化磷酸化酶 mtDNA 都很容易受到 ROS 的损伤。直接损伤线粒体的蛋白可降低底物与辅的亲和力。因为线粒体产生 ROS 的场所是线粒体基质， mtDNA 也位于线粒基质，离 ROS 的产生之处太近，使线粒体的基因组比核基因组更容易发生突。 mtDNA 的损伤将导致与呼吸链相关的肽合成水平降低。除了通过有氧呼吸为细胞提供能量外，线粒体还承担了许多其他生理功能。

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图 1-2 现有的成功靶向递送到线粒体的策略。缩略词：ATP,三磷酸腺苷；TOM/TIM，外膜转位酶/内膜转位酶；MTS,线粒体靶向序列；PNA,肽核酸；ODN,寡脱氧核苷酸；PTD,蛋白转导结构域；DQA, 地喹氯铵；DQAsomes，地喹氯铵的脂质体样囊泡。Fig.1-2 Current approaches being used for successful mitochondrial specific delivery.Abbreviations: ATP, adenosine triphosphate; TOM/TIM, translocase of theoutermembrane/translocase of the innermembrane; MTS, mitochondrial targeting sequences;PNA, peptide nucleic acids; ODN, oligodeoxynucleotides；PTD, protein transduction domain;DQA, dequalinium; DQAsomes, dequalinium based liposome-like vesicles.第二种靶向策略是基于线粒体靶向序列（mitochondrial targeting sequences，MTS）。大部分线粒体蛋白是核编码的，它们转运到细胞质并进入到线粒体。这些蛋白的 N 端大部分都含 MTS 多肽序列，能够将蛋白靶向转运到线粒体中。70%左右的 MTS 富含碱性氨基酸、带羟基的氨基酸和疏水氨基酸。这些碱性氨基酸带正电荷有利于 MTS 与带负电的线粒体膜相结合[86]。许多研究报道利用 MTS靶向于线粒体，将限制性内切酶导入到线粒体中进行基因治疗。例如，限制性内切酶Sma1与 MTS 共价连接，靶向导入到线粒体中发挥作用。结果表明导入 Sma1与 MTS 相融合的序列后，线粒体 DNA 的相关突变被消除[87]。另外，MTS 基因

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图 1-3 线粒体靶分子 TPP， DQA 和 KLA 修饰的脂质体成分的示意图[104]。Fig.1-3 Schematic diagrams for the mitochondria targeted agents TPP, DQA and KLAfunctionalized liposomes component[104].最近，报道了一种 pH 敏感线粒体靶向的脂质体，该脂质体可用于递送化疗药紫杉醇到线粒体[105]。肽段D[KLAKLAK]2（缩写为 KLA）一端与 2，3-二甲基顺丁烯酸酐（2，3-dimethylmaleicanhydride， DMA）相连，一端与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（distearoyl phosphoethanolamine ，DSPE）相连，形成嵌段聚合物DSPE-KLA-DMA。DMA 在 pH (~6.8)的肿瘤微酸环境中具有电荷反转的特性。该脂质体在体内循环分布时带负电荷，有利于降低血液清除率。当脂质体到达肿瘤的微酸环境时，DMA 从带负电反转为带正电，有利于选择性积累于线粒体。KLA 肽段有利于靶向于线粒体。体内和体外实验结果均表明，该线粒体靶向的脂质体对 A549 细胞和 A549 紫杉醇耐药细胞都具有增强的抗肿瘤效果[105]。1.5.2 线粒体靶向的聚合物纳米材料

【参考文献】