仿生软骨梯度支架的构建及掺杂石墨烯研究

发布时间：2020-07-20 08:16

【摘要】：关节对于骨骼动物的运动机能至关重要,在活动中发挥重要作用,正常关节的骨软骨组织结构呈现出明显的梯度渐进性和复杂的生理学特性。关节软骨是包覆在关节面上的一层无血管、无神经的含有少量细胞的终末端分化的多相结缔组织。其中的细胞及胶原纤维等也存在复杂的梯度渐进性。关节软骨因在各种活动中使用频繁,极易导致病变及损伤。目前几种修复手段的效果非常有限,因此,寻找创新性的修复方法是目前基础科研及医务工作者努力的方向。近几年组织工程技术的迅速发展为软骨修复提供了新思路。现有组织工程学研究大多着重于解决支架材料的生物相容性问题,较少有兼顾构建仿生骨软骨梯度渐进性的生理分层结构与具有良好生物相容性的支架材料的研究。本论文以具有互补特性的天然材料壳聚糖(Chitosan,Cs)、β-甘油磷酸钠(β-Sodium Glycerophosphate,GP)、明胶(Gelatin,Gel)为基础原料,基于多元耦合仿生理念,协同发挥各原料的功能优势,采用连通器型制备装置形成孔道结构的梯度渐进性,通过调控原料配比来调节支架的孔径,采用冷冻干燥技术致孔,首先制备了类似软骨天然构造并具有良好生物相容性和可降解性的Cs/GP/Gel仿生软骨梯度支架材料。结果表明,梯度支架材料拥有许多共性:优异的三维多孔结构,孔径介于20~180μm,孔道相互贯通,孔壁多褶皱,在高度方向上呈现出明显的生理分层结构和孔径梯度渐进性。随着Cs的增加,梯度支架材料的孔径逐渐增大,直至出现肉眼可见的较大孔径,且梯度渐进性越来越不明显。而对照组支架的孔径较均匀,未出现上述梯度现象,从侧面证实了制备的梯度支架材料很好地模拟了真实软骨的生理分层结构。为制备与软骨组织天然构造和性能更加吻合且具有良好生物相容性和物化特性的支架材料,将纳米羟基磷灰石(Nano-Hydroxyapatite,nHAp)复合在Cs/GP/Gel水凝胶中,进行二次梯度构建梯度支架材料(含钙化层)。整体梯度支架材料上部仿生软骨层很好地保持了Cs/GP/Gel梯度支架材料的良好孔道特征,说明这种梯度渐进性具有很好的可重复性;中部仿生软骨钙化层与上部仿生软骨层衔接良好;底部仿生软骨钙化层的孔径很小,可以有效阻隔两侧的软骨细胞和成骨细胞。为探究添加石墨烯(Graphene,Gr)对支架生物相容性的影响以及电磁刺激对支架中BMSCs的作用情况,将Gr掺杂进Cs/GP/Gel水凝胶中,赋予其一定的电磁传导功能,制备Cs/GP/Gel/Gr电磁支架材料。结果表明,支架微观为优异的三维多孔结构,孔壁呈灰黑色、多褶皱且观察不到Gr片层,与对照组无异,吸水率、孔隙率分别介于250.28±13.16~424.27±19.32%、74.81±1.21~85.42±2.59%,相同测定条件下,略低于对照组,但其弹性模量普遍高于相同配比的对照组。Gr片层以纳米尺度连续均匀地镶嵌在支架孔壁上,不会改变支架本身的孔道分布,且对支架孔壁起到加固作用。为检测制备的各支架的生物相容性及电磁刺激对支架中细胞生长的影响,将提取的SD大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)以相同细胞密度接种于各支架上。(1)Cs/GP/Gel仿生软骨梯度支架材料:支架上的细胞数量在孔径的梯度方向上也呈现梯度排列,孔径越小、孔道越连贯的区域存活的细胞密度越大。24 h时已有大量细胞黏附到支架孔壁上,突触有开始伸展的趋势,72 h时BMSCs已基本完全铺展在支架表面。而相同配比的对照组支架未出现上述梯度现象,其上24 h时截留的细胞数目和72 h时细胞的铺展状态等也明显劣于梯度支架。因此,制备的具有仿生生理分层结构的梯度支架材料生物相容性良好,更接近天然软骨的真实构造,更适合作为软骨修复用仿生支架材料。(2)仿生软骨梯度支架材料(含钙化层):仿生钙化层中细胞充分铺展且已伸展进支架内部;仿生软骨层的生物相容性有良好的可重复性,Cs/GP/Gel/nHAp支架模拟的钙化层可有效衔接仿生软骨层和仿生软骨下骨层,起到良好的过渡、沟通和衔接作用。(3)Cs/GP/Gel/Gr电磁支架材料:掺杂Gr会增大支架的细胞黏附率。24 h时支架孔壁上及孔道内已有大量细胞黏附且有开始铺展的趋势,72 h时BMSCs已基本完全铺展在支架表面上,细胞间存在突触连接。相同配比的对照组支架上截留的细胞数量明显少且生长进程明显慢。这说明将适量Gr以纳米尺度均匀镶嵌在支架孔壁上能适当调节其亲疏水性能,同时增大其表面粗糙度,为细胞提供更大的铺展面积和更多的附着位点,加速细胞在其上生长行为的进行,并且满足实验对电磁特性的要求。(4)BMSCs-Cs/GP/Gel/Gr电磁支架材料间歇电磁刺激:电磁刺激会增加BMSCs在支架上的黏附率,施加电磁刺激的电磁支架上的细胞黏附率增加为正常培养箱中的111.66%。电磁刺激环境下,Cs/GP/Gel/Gr电磁支架在24 h时出现许多已铺展的细胞,比正常培养箱中的构建体整合更快速,72 h时BMSCs充分铺展在支架孔壁上,极少发现类似正常培养箱中球形未铺展的细胞。因此,适当强度的电磁刺激有利于BMSCs在支架上的黏附生长。
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TB39

【参考文献】