金—碳量子点探针的制备与细胞器成像应用

发布时间：2020-08-06 15:17

【摘要】：由于具有发射光谱可调控、生物相容性好、易于功能化等优异的特性,碳量子点已成为生物医学领域中具有广泛应用前景的荧光纳米材料之一。然而微观尺度的生命或生理活动总是复杂多变,单一的荧光纳米材料逐渐无法满足日益增强的应用需求。纳米复合材料由于集成了诸多功能和优点正不断吸引研究者们的关注。本文通过微波辅助法制备了一种基于碳量子点的、具有高生物相容性的纳米复合荧光材料。由于其微小的尺寸和独特的光学特性,金-碳量子点可应用于细胞器成像。本文选用外泌体作为代表性的细胞器进行金-碳量子点的荧光成像应用。外泌体是一种携带大量特异性蛋白质和遗传物质的囊泡,它参与了细胞间物质和信息的传递,是细胞间信息传递系统的重要组成部分。特别是,癌细胞衍生外泌体参与了癌症的侵袭与转移。因此开展癌细胞衍生外泌体的荧光成像研究对癌症的早期诊断和治疗具有重要的科学意义。在本文的研究中,金-碳量子点被用作荧光团用于癌细胞衍生外泌体的成像。我们在金-碳量子点的表面修饰能够靶向癌细胞衍生外泌体的特异性抗体,合成了能特异性识别外泌体的纳米探针。该金-碳量子点纳米探针可以通过免疫反应标记癌细胞衍生外泌体,从而实现外泌体的荧光成像。当与活细胞共孵育时,金-碳量子点纳米探针标记的外泌体可以被细胞所摄取。细胞内成像实验证实,被细胞摄入的大部分外泌体通过溶酶体途径进行细胞内的生物降解,并且细胞摄取外泌体的方式和外泌体在细胞内的分布不受金-碳量子点标记的影响。这些荧光成像研究结果表明本文合成的金-碳量子点纳米探针可用于研究癌细胞衍生外泌体在细胞内的行为,是一种具有优异应用前景的新型功能化纳米荧光材料。
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TB383.1;R318.08;O657.3
【图文】：

示意图,微波辅助,法制,原理

东南大学硕士学位论文胺（PEI）具有反应活性高、生物相容性好、价格低等优点，我们首先利用静电吸附将聚乙烯亚胺（PEI）修饰在金-碳量子点的表面得到 PEI 修饰的金-碳量子点（PCDs）。PEI 的胺基可以与抗体的羧基反应形成酰胺键，因此，抗体可以与 PEI-GCDs缀合。由于我们使用的外泌体来源于乳腺癌细胞（SKBR3 细胞），HER2 存在于源KBR3 细胞的外泌体的膜上，因此可以选择 HER2 作为外泌体的识别单位。所以我用了兔抗HER2这个抗体与PEI-GCDs进行偶联。我们使用EDC与NHS作为催化剂兔抗 HER2 修饰在了 PEI-GCDs 表面。最后，我们获得了所需的纳米探针。

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图 2-2（a）GCDs、PEI-GCDs 和纳米探针的吸收光谱。（b）GCDs、PEI-GCDs 和纳米探针的激发光谱，光子在 465nm 处收集。（c）GCDs 的荧光光谱（插图：日光和紫外光下 GCDs 的图像）。（d）当激发波长为 370 nm 时，GCDs、PEI-GCDs 和纳米探针的荧光光谱。（e）GCDs 的 EDS 分析结果。（f）GCDs 和 PEI-GCD 的 FTIR 光谱。（g）A647、FITC、QDs 和 GCDs 的光漂白验证实验，A647、FITC、QDs 和 GCDs 的激发波长分别为 642nm、488nm、405nm 和 405nm。（h）对 HeLa 细胞用不同浓度的量子点和 GCDs 培养 24 小时后的细胞存活率。（i）A647、FITC、QDs 和 GCDs 的荧光强度比较图。2.6 本章小结本章主要利用微波辅助法制备出了尺寸形貌均一，分散性良好的金-碳量子点，并在此基础上以 PEI 为连接剂在表面修饰上抗体合成了金-碳量子点探针。通过与其他三种具有代表性的荧光染料进行光稳定性、生物相容性与荧光强度方面的比较，对 GCDs的性能进行了讨论。尽管在荧光强度方面 GCDs 比有机染料（例如 A647 和 FITC）和

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0 μL 的 PEI-GCDs 溶液，150 μL 的按照 1：100 的比例稀释在体和 1μL 质量分数为 50%戊二醛溶液置于离心管中并在室温下振 0.3μL 的红色细胞膜染料 DiD 加入到溶液中，对外泌体进行染色剧烈震荡 20 分钟。最后，通过分子量为的 50Kda 的超滤管以 60滤提纯 20 分钟除去过量试剂，所得产物用 PBS 稀释备用。完成在荧光成像过程中对图像的采集，在对外泌体进行荧光成像作用将外泌体固定在腔室盖玻片上中。首先，将 Lab-TekII 腔室为 0.1%的 PEI 水溶液中并保持 30 分钟以确保盖玻片装配有足将制备好的样品加入到带有正电荷的盖玻片中并在室温下静置成像缓冲液是 PBS。使用 Zeiss Elyra P.1 显微镜系统在全内反tion，TIRF）模式下配备 100X 油浸物镜进行成像实验。成像时对通道：激发波长：642nm，荧光收集波段：655nm-690nm；纳米激发波长：405 nm，荧光接收波段：495 nm-575 nm。

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