缺氧和单线态氧双重响应的多功能胶束促进光动力学抗癌疗法的研究

发布时间：2020-08-11 13:05

【摘要】：光动力学疗法(PDT)具有低副作用,高选择性,可重复性和非侵入性的优点,因此在癌症治疗领域虽已得到广泛关注。光敏剂、氧气和光源是PDT的三大要素,但PDT面临小分子光敏剂的水溶性差和肿瘤靶向性差的问题。纳米技术可通过多种机理增强PDT抗癌疗效,包括增加疏水性光敏剂的水溶性、延长药物体循环时间、实现载体的被动和主动靶向、促进光敏剂的细胞摄取,以及光敏剂的应答控释等。然而传统的PDT纳米载体经过静脉给药和体内生物分布后,大多数药物累积在健康器官中,光敏剂在肿瘤部位的富集非常差。由于目前尚无有效的方法来显著提高药物在肿瘤部位的含量,因此充分利用血液循环后累积于肿瘤组织中的光敏剂是提高PDT疗效的一种重要手段。纳米载体进入肿瘤组织后的高效细胞摄取和光敏剂的应答释放是提高PDT疗效的两个关键步骤。通过增加肿瘤细胞摄取可确保肿瘤细胞内药物的高浓度;而光敏剂的快速释放可以克服单线态氧半衰期短和扩散距离有限引发的疗效降低。聚合物胶束是一种重要的纳米载体。它一般由亲水性聚乙二醇(PEG)构成外壳,用于保持载体的生物相容性和血液稳定性;疏水聚合物链段构成内核用来包载疏水性药物分子。然而PEG修饰后纳米粒的细胞摄取通常会减弱,从而引发PDT疗效降低。PEG在肿瘤微环境下的可控去除为增加纳米药物的细胞摄取提供了新思路。肿瘤组织的氧气含量很低,利用缺氧作为刺激条件可以降低纳米载体的表面亲水性,从而促进载体和细胞膜之间的相互作用,有助于纳米载体的细胞内吞。偶氮苯是典型的缺氧敏感基团,可作为去PEG化的两亲性聚合物的亲水/疏水链段间的连接分子。虽然PEG的应答脱除可增加纳米药物的细胞摄取,但没有PEG保护层的纳米载体非常容易聚集,进而阻碍药物的释放。刺激响应型纳米胶束载体可通过功能基团的质子化、水解或分子构型的转变等途径来实现药物的可控释放。例如细胞内高谷胱甘肽浓度(约10 mM)或内含体/溶酶体的酸性微环境是典型的内源型刺激物。鉴于单线态氧的高反应活性,其可作为高效的刺激物来实现负载物的可控释放。本课题假设具有低氧和单线态氧双重敏感特性的纳米胶束具有PEG可控脱除和光敏药物应答释放两个优点。此外,双应答还具有协同作用,缺氧微环境可以提高细胞内用于PDT的光敏剂剂量,单线态氧的生成将加剧肿瘤组织缺氧的程度,进而促进后续未入胞纳米粒的摄取。因此,本课题拟设计一种缺氧和单线态氧双重响应的多功能纳米胶束,并包载光敏剂以增强光动力疗法的疗效。通过利用单端甲氧基的两亲性聚(乙二醇)-偶氮苯-聚(天冬氨酸-咪唑)(mPEG-Azo-PAsp-IM)嵌段共聚物的自组装制备胶束,其中偶氮苯和咪唑基团分别是为低氧和单线态氧敏感的功能基团,二氢卟吩e6(Ce6)作为模型光敏剂物理包载于胶束中。含有偶氮苯和咪唑的两亲性聚合物经过以下三个主要步骤合成,首先,将偶氮苯连接到mPEG的末端生成末端氨基的mPEG,即mPEG-Azo-NH_2;然后mPEG-Azo-NH_2充当引发剂引发天冬氨酸N-羧酸酐单体的开环聚合;最后,通过酰胺化反应将咪唑基团接枝到多肽骨架上,最终获得低氧和单线态氧双重响应性嵌段聚合物mPEG-Azo-PAsp-IM。利用没有偶氮苯修饰的mPEG用作引发剂来合成仅对单线态氧敏感的两亲性聚合物(即mPEG-PAsp-IM)作为对照。所有中间产物和终产物均经过合适的方法纯化,并通过核磁共振(~1H NMR和~(13)C NMR),质谱和红外光谱进行了结构验证。通过~1H NMR分析,最终合成的两种聚合物分子的氨基酸聚合度均约为20,咪唑基团的接枝率均为100%,分子量分别约为9,600 Da(mPEG-Azo-PAsp-IM)和9,400 Da(mPEG-PAsp-IM),两种聚合物的分子量差异约等于偶氮苯的分子量。本课题采用传统的薄膜水化法制备缺氧和单线态氧双重响应的纳米胶束,两亲性嵌段聚合物在水性介质中由于自身的两亲性自组装形成纳米胶束。为了评价胶束稳定性,使用芘作为荧光探针测定其临界胶束浓度(CMC)。该双响应(DR)mPEG-Azo-PAsp-IM胶束的CMC较低(1.1μM),有利于维持纳米胶束的血液循环稳定性并防止药物提前释放。光敏剂Ce6通过用薄膜水化法包载于胶束疏水腔,采用高效液相色谱法(HPLC)测得DR载药胶束(mPEG-Azo-PAsp-IM/Ce6)的Ce6载药量为4.1±0.5%(w/w),SR载药胶束(mPEG-PAsp-IM/Ce6)的Ce6载药量为3.7±0.3%(w/w)。动态光散射(DLS)测得DR空白胶束水力学直径为157±14 nm,DR载药胶束的粒径增加到189±19 nm,这是由于Ce6的存在引起的胶束疏水核膨胀的结果,这种粒径增加是胶束成功载药的典型现象。为了验证缺氧诱导的偶氮苯断键,本实验分别采用缺氧和常氧两种条件处理CMC以上DR聚合物分子,其中肿瘤组织缺氧还原性环境通过用氮气替换空气的装置,同时加入NADPH:醌型氧化还原酶1(NQO1)和辅酶NADPH来模拟。紫外-可见光谱显示,缺氧条件下,DR胶束的偶氮苯在378 nm处的特征峰的强度随着低氧处理时间的增加而持续减弱,表明了低氧可诱导偶氮苯断键。同时水力学粒径用作另一个指标来评估偶氮苯的完整性,在缺氧条件下,24小时内DR胶束的粒径增加了约10倍以上。这是偶氮苯断键引起的胶束解体,进而引起胶束聚集导致的。常氧环境下,DR胶束的偶氮苯在378 nm处的特征峰几乎没有变化,并且24小时内DR胶束的粒径也没有变化,表明了常氧条件下偶氮苯结构保持完整,胶束维持稳定。为了验证DR载药胶束的单线态氧响应性,基于在660 nm的激光照射下,胶束包载的Ce6能够产生单线态氧,并且产生量会随光照时间的增加而增加。本课题发现,单线态氧能够氧化咪唑基团生成亲水性的脲结构,导致聚合物分子亲疏水性不平衡继而使胶束膨胀。本实验分别在光照和不光照的条件下测定载药胶束的粒径变化。实验发现,激光照射条件下,载药胶束的粒径显著增加,通过动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)验证了这种粒径的变化,半小时的激光照射(660 nm,100 mW/cm~2)使DR胶束的粒径增加了数倍。由于DR胶束在单线态氧诱导下咪唑结构变为亲水性的脲结构,使胶束亲疏水比例失衡,但脲结构的氢键相互作用使得胶束没有崩解,而是表现为粒径增大。相比之下,没有光照的情况下,DR载药胶束的粒径保持恒定,这是由于聚合物没有单线态氧诱导的结构改变而使胶束维持稳定。因此,激光照射下,DR载药胶束能够快速释放包载的Ce6。这种胶束粒径变化引发的Ce6快速释放可有效解决光动力疗法中单线态氧半衰期短和的扩散范围有限的问题。为了研究缺氧环境下,偶氮苯基团对Lewis肺癌(LLC)细胞摄取胶束的影响。首先,我们合成了异硫氰酸荧光素(FITC)标记的DR和SR两种聚合物(即mPEG-Azo-PAsp-IM-FITC和mPEG-PAsp-IM-FITC)作为大分子荧光探针来表征胶束摄取情况,通过~1H NMR分析验证了FITC标记聚合物的成功合成。通过聚合物自组装获得荧光响应性DR-FITC胶束和SR-FITC胶束。在常氧条件下,两种类型胶束的细胞摄取程度相近(p0.05);相反,缺氧条件下DR胶束的细胞摄取程度显著高于SR胶束(p0.01)。这是由于低氧环境下胶束去除亲水性PEG外壳将增强纳米载体和疏水性细胞膜之间的亲和力,进而使纳米药物摄取增强的原因。另外,包载Ce6的DR和SR胶束在低氧和常氧条件下的细胞摄取实验进一步分析验证了偶氮苯对细胞摄取载药胶束的影响。Ce6的固有荧光强度与FITC标记的胶束观察到相似的趋势,即常氧下DR和SR两种载药胶束的Ce6荧光强度相近;缺氧环境下,DR载药胶束的Ce6荧光强度远大于SR胶束,这进一步证明了LLC细胞对DR胶束摄取的程度随环境缺氧程度的增加而增加。LLC细胞的细胞毒性实验分别在缺氧/常氧的环境下、激光照射/不照射的条件下进行。在缺氧环境下进行激光照射(10 min,660 nm,100 mW/cm ~2)时,测得游离Ce6的IC_(50)为2.6±0.4μg/mL,包载Ce6的SR和DR胶束的IC_(50)分别为5.3±0.7μg/mL和2.4±0.3μg/mL。由于没有释放屏障,游离Ce6显示出比载药胶束更强的细胞毒性(p0.05),游离Ce6和DR胶束的细胞毒性相近(p0.05),这可能是由于DR胶束的摄取更多所致。DR胶束的IC_(50)远小于SR胶束,这是由于相对于SR胶束,低氧诱导的偶氮苯断键和PEG脱落导致的DR胶束摄取增加所致。虽然单线态氧敏感的SR胶束可以通过快速释放Ce6增强细胞毒性,但DR胶束因为不仅能够增强胶束的细胞摄取而增加Ce6的摄取量,并且通过光响应快速释放Ce6而表现出更强的细胞毒性。在没有激光照射的细胞中,游离的Ce6,包载Ce6的DR胶束和SR胶束都没有细胞毒性,因为光敏剂在没有光照时不能够产生单线态氧,同时也表明了DR空白载体(mPEG-Azo-PAsp-IM)和SR空白载体(mPEG-PAsp-IM)对LLC细胞的正常生长无影响。在常氧环境下进行激光照射(10 min,660 nm,100 mW/cm ~2)时,测得游离Ce6的IC_(50)为2.0±0.2μg/mL,包载Ce6的SR和DR胶束的IC_(50)分别为4.8±0.5μg/mL和4.9±0.6μg/mL,游离Ce6依旧显示了最大的细胞毒性。由于分子氧是光动力疗法中单线态氧产生的三个关键元素之一,所以缺氧/常氧两种条件下游离Ce6和Ce6载药SR胶束的细胞毒性之间显示了显著差异(p0.05)。当光敏剂类型,浓度和照射条件相同时,分子氧的水平将影响单线态氧产生的效率,高氧含量能够确保产生更多单线态氧,因此相对于低氧环境,常氧下游离Ce6和Ce6载药的SR胶束具有更强的细胞毒性。然而这种趋势并不适用于Ce6载药的DR胶束,这是由于低氧环境下DR胶束的偶氮苯断键增加了Ce6的摄取所致。给LLC癌细胞荷瘤小鼠尾静脉注射游离Ce6,包载Ce6的DR胶束和SR胶束三种样品,通过观察Ce6荧光强度对Ce6在小鼠体内的生物分布进行半定量评估。两种胶束都能够通过增强的通透性和滞留(EPR)效应将更多的光敏剂递送至肿瘤部位,这是被动靶向作用的结果。通过在固定时间点(给药后2小时,4小时,6小时,8小时和24小时)的观察,EPR效应在8小时达到峰值。对于两种类型的刺激响应性胶束,Ce6的肿瘤积累都是类似的,这是因为DR胶束和SR胶束显示出相似的纳米药物性质(例如粒径,表面化学性质)。与游离Ce6相比,两种类型的胶束都在肿瘤组织中累积更多的Ce6。由于给药样品随血液循环导致的全身性生物分布,所以三种样品在主要器官(心脏、肝、脾、肺和肾)中也存在不可避免的药物沉积。尽管DR胶束并没有表现出明显优越于SR胶束的生物分布性质,但体内抗肿瘤实验证明DR胶束具有优于SR胶束的治疗效果。鉴于这两种类型的响应胶束向肿瘤部位递送Ce6量是相同的,但由于DR胶束将细胞摄取增加和快速释放药物相结合发挥抗肿瘤作用,因此治疗效果更佳。众所周知,缺氧是实体瘤的特征,这能够使偶氮苯断键进而帮助PEG从胶束表层脱落,从而增加细胞对Ce6载药胶束的摄取。另外,激光照射下Ce6消耗分子氧并加剧肿瘤部位缺氧的程度,进一步增加细胞对DR胶束的摄取。这两种因素相互作用的价值在于能实现光敏剂高效递送到肿瘤部位且快速释放进而发挥更好的治疗效果。相比之下,由于仅有EPR效应和药物的快速释放作用,SR胶束在抗肿瘤效果次于DR胶束,但优于游离Ce6的作用。阴性对照(磷酸盐缓冲盐水/PBS)无抗肿瘤作用。小鼠经四种给药样品治疗后体重都维持稳定,表明了样品没有系统毒性。一般认为,PDT的治疗机理主要是单线态氧诱导的细胞凋亡,这可通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)表征。本实验发现阴性对照(PBS)无绿色荧光出现表明不能诱导细胞凋亡;游离的Ce6仅引起微弱的细胞凋亡效应,表明其在肿瘤部位的积累较差导致的不理想治疗效果;由于被动靶向效应,SR胶束和DR胶束产生显著的凋亡效应,但DR胶束治疗的肿瘤中的绿色荧光强度大于SR胶束表明了前者能够导致更高程度的细胞凋亡,这一结果与抗肿瘤实验结果一致。肿瘤组织中细胞核的数量和完整性排列如下:PBS游离Ce6SR胶束DR胶束,所有这些数据均表明双重响应的DR胶束可以通过缺氧增加细胞摄取和单线态氧触发药物快速释放协同作用使PDT功效最大化。综上所述,我们设计了一种低氧和单线态氧协同增效的抗肿瘤PDT纳米载药体系。由于被动靶向的纳米制剂的肿瘤累积通常较差,本课题的研究将增加光敏剂的细胞摄取和单线态氧触发的光敏剂快速释放结合,表现出了更优的治疗效果。这种含偶氮苯和咪唑的聚合物的自组装产生缺氧环境和单线态氧双重响应性胶束,通过缺氧响应增加细胞内光敏剂累积量,而单线态氧响应性不仅触发了光敏剂的释放,而且进一步降低了细胞内氧气水平,从而增加胶束的摄取。本课题将胶束自组装、刺激响应性增强细胞摄取、应答释放相互协同作用集成于一个多功能胶束体系中,实现了高效递送光敏剂、增加PDT疗效的目的。
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R73-36;TB383.1;O631

【相似文献】