壳聚糖基载银材料的制备及其抗菌性能的研究

发布时间：2020-10-14 19:10

　　 壳聚糖作为一种天然高分子材料,由于其优异的生物相容性、生物降解性、抗菌性,以及促伤口愈合能力,被认为是最具应用前景的抗菌材料之一。然而,壳聚糖的水溶性差,只能在酸性条件下溶解并发挥抗菌作用,这极大的制约了其在生物体环境中的应用。此外,壳聚糖的抗菌性能较弱,单一的壳聚糖材料较难满足临床上复杂的抗菌要求。因此,通常需要将壳聚糖与其他抗菌剂结合以增强其抗菌性能。在众多抗菌剂中,纳米银由于具有广谱的抗菌性且无耐药性问题,成为了研究最为深入、应用最为广泛的抗菌添加剂之一。但纳米银潜在的细胞毒性问题也一直制约着其在生物体内的应用。本研究拟通过将生物相容性极佳的壳聚糖与抗菌性能极强的纳米银复合,制得兼具强效抗菌与生物无毒的新材料。具体研究成果如下:(1)通过酰胺化反应将小分子邻苯二酚接枝到壳聚糖分子上,制得了水溶性极佳的改性壳聚糖(CSS),解决了壳聚糖只能在酸性条件下发挥抗菌作用的问题。利用邻苯二酚的还原性以及壳聚糖的稳定作用,将CSS作为还原剂和稳定剂,可一步法制得了粒径均一且稳定性高的复合纳米银(CSS-AgNPs)。这种复合纳米银兼具了壳聚糖与纳米银的双重优点:纳米银赋予了它突出的抗菌性能,而外层包裹的壳聚糖衍生物又使其细胞毒性显著降低。细胞和细菌实验证明,CSS-AgNPs在适宜的剂量浓度下,可有效杀灭细菌而不对人体细胞产生毒性作用,有望被应用于生物医用领域。(2)针对纳米银和壳聚糖的抗菌机理仍不明确这一问题,我们借助TEM和SEM等显微成像技术和生化分析技术,深入研究了革兰氏阴阳细菌被CSS-AgNPs作用后的微观形态学变化,揭示了 CSS-AgNPs具体的抗菌作用机理。研究发现,CSS-AgNPs对革兰氏阴性菌的杀菌性能明显强于阳性菌。这种特异性的抗菌作用与革兰氏阴阳两种细菌不同的细胞壁结构相关。CSS-AgNPs杀死阴性菌的关键在于破坏其致密且厚的细胞壁,而对细胞膜通透性的破坏是革兰氏阴性菌被杀死的主要机理。(3)利用CSS-AgNPs表面的儿茶酚基团与壳聚糖凝胶网络中的氨基形成相互作用,可将CSS-AgNPs牢牢地固定在壳聚糖海绵的内部以实现纳米银的缓释。这种新型壳聚糖基载银复合海绵具有优异的长效抑菌性能,可有效抑制革兰氏阴阳两种细菌的增殖达到72h以上。同时杀菌性能显著,有效杀菌率为99.99%。当载银量在0.63±0.09%时,复合海绵既具有优异的杀菌性能和长效抑菌性能,细胞毒性也很低,是一种极具临床应用前景的抗菌敷料。(4)将带负电荷的聚噁唑啉衍生物与带正电荷的CSS-AgNPs进行静电自组装,制得具有pH响应性杀菌兼抗粘附性能的多层膜。我们合成了末端为甲氧羰基的噁唑啉单体,将其与末端为乙基的噁唑啉单体,按照一定的投料比聚合,制得了羧基单元比从高到低的三种聚噁唑啉衍生物。羧基的引入使本来不带电的聚噁唑啉具有了电负性,电荷密度与羧基单元比含量成正比。研究发现,该静电自组装中存在“临界电荷密度效应”。当聚噁唑啉衍生物的电荷密度小于某临界值时,组装无法连续进行。而当电荷密度超过临界值时,组装可以顺利进行,且聚电解质的吸附量随电荷密度的降低而增大。该静电自组装多层膜呈指数型增长,这是弱聚电解质在多层膜中“穿插渗透”导致的。接触角实验表明,多层膜的最外层为聚噁唑啉衍生物时具有很好的亲水性,有望在生物体内发挥较好的抗细菌粘附效果。体外释放测试实验表明,该多层膜具有明显的酸响应释放特性。环境pH的降低会使多层膜中聚噁唑啉上的羧基电离程度减小,其与CSS-AgNPs的作用力减弱,部分纳米银颗粒就会从多层膜中释放出来。这一特性有望被应用于刺激响应性杀菌领域。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：O636.1;TB33
【部分图文】：

螯合以及絮凝作用，将壳聚糖用于工业废水、生活污水的处理Ｕ１］。??１．２．２壳聚糖在生物医用领域的应用??除了较强的化学反应活性外，壳聚糖还具有许多优良的生物特性（见下图１．２），具??体表现在以下几方面（１）作为天然生物高分子，可生物降解，且降解产物无毒无??害，生物相容性好；（２）可与哺乳动物和微生物细胞相结合；（３）促进结缔组织的再生，??加速伤口愈合；（４）促进成骨细胞的生成，加速骨再生；（５）具有止血、抗菌、抗肿瘤??等作用。??２??

以促进新生肉芽的形成和大量血管的再生，并具有一定的镇痛作用［２２］。各类壳聚糖基??衍生物材料以膜、海绵、水凝胶等多种形式，作为伤口敷料申请专利保护并成功投放市??场，如３Ｍ公司研发生产的Ｔｅｇａｓｏｒｂ和Ｔｅｇａｄｅｒｍ?（详见下图１．３），以及美国ＩＭＳ公司??的?Ｃｈｉｔｏｄｉｎｅ?等［８］。??３Ｍ＇?Ｔ＾ａｄｅｒｍ＂?ａｎｄ?Ｔｅｇａｄｅｒｍ＂?ＨＰ??Ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ?Ｄｒｅｓｓｉｎｇｓ??Ｔｈｅ?ｃｌｅａｒ?ｃｈｏｉｃｅ?ｆｏｒ?ｅａｓｙ?ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｅｘｔｅｎｄｅｄ?ｗｅａｒ?ｔｉｍｅ??羽嫻＝??图１．３左图为壳聚糖基商用止血材料ＣＥＬＯＸ的产品外观及使用场所示意图，右图为壳??聚糖基伤口敷料Ｔｅｇａｄｅｒｍ的产品外观及适用部位示范图。??１．２３壳聚糖基抗菌材料的研宄进展??作为一种天然的中性高分子材料，壳聚糖由于其固有的抗菌性能和来源广泛、产量??高等特点，被认为是最理想的抗菌材料之一，备受国内外学者的关注［９］。现阶段，关于??壳聚糖抗菌作用的确切机制尚无定论，但现有的研究成果正在逐渐揭开这一面纱，新的??猜想不断被提出并在一定程度上得到了验证。??有研宄表明，带正电荷的壳聚糖分子和带负电荷的微生物细胞膜之间的相互作用会??导致细菌的生物膜发生破裂，随后蛋白质和其他细胞内成分会发生泄漏，进而导致细菌??的死亡［ｉａ２３＿２６］。在较低浓度时，带正电荷的壳聚糖与带负电荷的细菌表面结合会导致细??菌的聚集

液的抑菌作用具有浓度依赖性。并观察到细胞膜对小分子细胞组分的通透性增强与显著??的细胞膜去极化现象相伴而生。但没有观察到阻碍细胞壁生物合成的现象。为了进一步??观察壳聚糖溶液的作用方式，扫描电镜被用于观察细胞的受损情况。结果如下图１．４所??示，与未经处理的对照组相比（图１．４ａ），经壳聚糖溶液处理５分钟后的葡萄球菌表面??就出现了不规则的突起物（图１．４ｂ），这可能是带正电荷的壳聚糖附着在了负电荷的细??菌表面。随着壳聚糖溶液处理的时间延长至２０分钟（（图１．４ｃ），细胞膜的局部开始轻??微地剥离细胞壁，壁膜间形成了小“空泡样”结构。这可能是胞内的离子和水发生了外??流，内部压力降低导致的。但是始终未曾观察到细胞壁的破裂，细胞膜的物理结构也保??持完整。转录响应数据分析显示，壳聚糖溶液处理后，金黄色葡萄球菌涉及调节应激和??自溶的ＳＧ５１１基因的表达谱以及与能量代谢相关的基因发生了多重变化。因此研究人??员推测，壳聚糖与磷壁酸的结合加上膜脂质（主要是脂磷壁酸）的潜在提取引发了一系??列事件
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本文编号：2841063