特异性识别糖蛋白纳米颗粒的制备及应用

发布时间：2020-11-10 07:59

　　 第一章硼酸功能化纳米颗粒的制备及性能评价目的:糖蛋白在许多生物过程中都起着重要作用,并且可以用作许多疾病的生物标志物。对糖蛋白进行有效分离在糖蛋白结构和功能研究中必不可少,因此制备高性能的糖蛋白分离、富集材料具有重要意义。利用硼酸可以与糖蛋白糖基上顺式二醇结合成酯的选择性结合特性,本研究在SiO_2纳米颗粒表面制备了两种不同硼酸分布形式的聚合物刷,通过对比分析研究硼酸功能化纳米颗粒吸附糖蛋白性能的结构-功能关系。方法:在SiO_2纳米颗粒表面修饰引发剂,然后以甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为单体,通过表面引发的原子转移自由基聚合(SI-ATRP)法,在SiO_2纳米颗粒表面制备了聚合物刷SiO_2@PGMA,并通过以下两种不同方法在其表面修饰叠氮基团:(1)酸化开环后加叠氮:用硫酸处理SiO_2@PGMA,将GMA支链环氧基开环羟化后,再用叠氮化钠对分子链主链末端Br活性位点进行修饰,得到仅在分子链主链末端带有叠氮基的SiO_2@PGMA-OH@N_3。(2)直接开环加叠氮:利用叠氮化钠与GMA上环氧基及主链末端Br活性位点反应,得到在分子链主链末端和支链均带有叠氮基的SiO_2@PGMA-N_3@N_3。最后通过叠氮-炔基的点击化学反应将炔基苯硼酸分别结合到两种带有叠氮基的纳米颗粒表面,分别得到仅在聚合物刷主链末端带有硼酸的SiO_2@PGMA-OH@BA,和在聚合物刷支链及主链末端均带有硼酸基团的SiO_2@PGMA-BA@BA。利用电镜、红外光谱、热重分析、元素分析的方法,分析两种颗粒的物理化学特征;使用茜素红S荧光发光法评价颗粒表面硼酸功能化水平;通过紫外分光光度法测定纳米颗粒在溶液中的分散性,静态吸附实验分析不同颗粒对糖蛋白的吸附量。最终分析不同纳米颗粒的硼酸化水平和溶液分散性对其糖蛋白吸附性能的影响。结果:红外光谱、热重分析、元素分析显示在SiO_2纳米颗粒表面成功修饰了两种带硼酸功能团的聚合物刷,其中在聚合物刷支链及主链末端均带有硼酸基团的SiO_2@PGMA-BA@BA的硼酸化水平高于仅在聚合物刷主链末端带有硼酸基团的SiO_2@PGMA-OH@BA,但是SiO_2@PGMA-OH@BA在水溶液中分散性更好。蛋白吸附实验显示,两种硼酸功能化纳米颗粒对糖蛋白的吸附平衡时间约为2小时。两种纳米颗粒对糖蛋白(卵清蛋白和辣根过氧化物酶)的吸附能力都显著高于非糖蛋白(牛血清白蛋白);且对糖基化水平更高的卵清蛋白的吸附量均明显高于糖基化水平较低的辣根过氧化物酶。两种颗粒对糖蛋白的吸附量均具有pH响应性,吸附量随pH的变化规律为pH 9.0pH 7.4pH 4.0。在聚合物刷支链及主链末端均带有硼酸基团的SiO_2@PGMA-BA@BA对卵清蛋白的最大吸附容量Q_(max)=153.40 mg/g,而仅在聚合物刷主链末端带有苯硼酸基团的SiO_2@PGMA-OH@BA对卵清蛋白的Q_(max)=126.70 mg/g,两者的Q_(max)无统计学差异。结论:本方法成功在SiO_2纳米颗粒表面修饰了两种硼酸化程度不同的聚合物刷,所得到的两种硼酸化程度不同的纳米颗粒均可特异性吸附糖蛋白,且对糖蛋白的吸附均有pH响应性。聚合物刷支链与主链末端均修饰硼酸的SiO_2@PGMA-BA@BA的硼酸化水平高于仅在主链末端修饰硼酸的SiO_2@PGMA-OH@BA,但前者在水溶液中的分散性较差,两者对卵清蛋白的最大吸附容量Q_(max)无显著差异,显示在吸附糖蛋白过程中发挥主要作用的是位于聚合物刷主链末端的硼酸功能团。第二章温度响应性硼酸功能化纳米颗粒的制备及性能评价目的:环境响应性纳米材料在生物分离、生物传感、基因传递、药物缓释等方面具有很好的应用前景。本章研究在第一章制备的硼酸功能化纳米颗粒基础上,引入温度响应性功能单体N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm),制备温度响应性的硼酸功能化纳米颗粒,进一步分析硼酸功能团分布特征、纳米颗粒水溶性、温度等因素对纳米颗粒吸附糖蛋白性能的影响。方法:使用第一章制备的表面含有引发剂的SiO_2纳米颗粒,在其引发聚合过程中,以NIPAm和甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)共同作为功能单体,通过表面引发的原子转移自由基聚合(SI-ATRP)法,在SiO_2纳米颗粒表面制备含有两种功能单体的NIPAm-co-GMA共聚物刷SiO_2@PNCG。然后通过以下两种方法对SiO_2@PNCG进行叠氮功能化:(1)硫酸酸化后再叠氮化,得到SiO_2@PNCG-OH@N_3;(2)直接叠氮功能化,得到SiO_2@PNCG-N_3@N_3。另外仅用NIPAm作为功能单体,SI-ATRP法合成聚合物刷SiO_2@PNIPAm,将SiO_2@PNIPAm分子链末端活性基团修饰叠氮功能团得到SiO_2@PNIPAm@N_3。最后通过叠氮-炔基的点击化学反应将炔基苯硼酸分别结合到三种带有叠氮的纳米颗粒表面,得到仅在共聚物刷主链末端带有硼酸基团的SiO_2@PNCG-OH@BA,在共聚物刷支链及主链末端均带有硼酸基团的SiO_2@PNCG-BA@BA,以及仅在聚NIPAm刷主链末端带有硼酸基团的SiO_2@PNIPAm@BA。利用电镜、红外光谱、热重分析、元素分析的方法,分析三种颗粒的物理化学特征;使用茜素红S荧光发光法评价颗粒表面的硼酸功能化水平;紫外分光光度法分别测定纳米颗粒在水溶液中的分散性;静态吸附实验分析不同颗粒对不同糖蛋白的吸附量,以及不同温度、pH条件下各种纳米颗粒的蛋白吸附性能。将温度敏感性纳米颗粒的性能与第一章所制备的非温度敏感性纳米颗粒性能进行对比,综合评价硼酸化水平、纳米颗粒在水溶液中的分散性等因素对不同纳米颗粒吸附蛋白性能的影响。结果:红外光谱、热重分析、元素分析显示在SiO_2纳米颗粒表面成功修饰了系列带硼酸功能团的温度响应性聚合物刷。其中NIPAm-co-GMA共聚物刷支链及主链末端均带有硼酸基团的SiO_2@PNCG-BA@BA的硼酸功能化水平最高,共聚物刷仅主链末端带有硼酸基团的SiO_2@PNCG-OH@BA次之,仅聚NIPAm刷主链末端带有硼酸基团的SiO_2@PNIPAm@BA最低。这三种温度响应性硼酸功能化纳米颗粒在水溶液中的分散性没有明显差异,均好于第一章中不含NIPAm的纳米颗粒,且在水溶液中的分散度具有温度响应性,在40℃时的分散性低于20℃时的分散性。三种纳米颗粒对糖蛋白(卵清蛋白和辣根过氧化物酶)的吸附量显著大于非糖蛋白(牛血清白蛋白)。且对糖基化水平更高的卵清蛋白的吸附量均明显高于糖基化水平较低的辣根过氧化物酶。三种颗粒对糖蛋白的吸附量都具有pH响应性和温度响应性,吸附量随pH的变化规律为pH 9.0pH 7.4pH 4.0,40℃时的吸附量显著低于20℃时的吸附量。在共聚物刷仅主链末端带有硼酸基团的SiO_2@PNCG-OH@BA对卵清蛋白的最大吸附容量Q_(max)=129.64 mg/g,共聚物刷支链及主链末端均带有硼酸基团的SiO_2@PNCG-BA@BA的Q_(max)=159.38 mg/g,聚NIPAm刷仅主链末端带有硼酸基团的SiO_2@PNIPAm@BA的Q_(max)=118.37 mg/g,三者之间没有统计学差异。结论:本方法所制备的三种温度响应性硼酸功能化聚合物刷修饰的SiO_2纳米颗粒,均可以特异性吸附糖蛋白,且对糖蛋白的吸附具有pH和温度响应性。三种纳米颗粒的硼酸化水平不同,但对卵清蛋白的最大吸附容量Q_(max)没有显著差异,说明在吸附糖蛋白过程中发挥主要作用的是位于聚合物刷主链末端的硼酸功能团。三种温度响应性硼酸功能化纳米颗粒在水溶液中的分散性均高于第一章非温度响应性的硼酸功能化纳米颗粒,但是5种纳米颗粒对糖蛋白的吸附量并无显著差异,说明硼酸功能化纳米颗粒在水溶液中的分散性不是影响其结合糖蛋白的主要因素。本研究有助于深入了解聚合物刷上特定功能团的位置和数量对特定功能的影响。第三章温度响应性硼酸功能化纳米颗粒用于糖蛋白分离目的:本章利用温度响应性硼酸功能化纳米颗粒开发用于复杂样品中糖蛋白的分离的新方法,探讨最低程度改变蛋白质溶液化学组成、最高程度分离纯化蛋白质的条件。将优化的条件应用于复杂样品中的糖蛋白分离,提高硼酸功能化纳米颗粒对糖蛋白的分离效率。方法:将第二章制备的三种温度响应性硼酸功能化纳米颗粒,加入辣根过氧化物酶和牛血清白蛋白的混合蛋白样品中,首先进行温度循环实验,分析温度对纳米颗粒吸附糖蛋白的影响变化;然后在混合蛋白样品中加入单糖再进行温度循环实验,分析温度与单糖联合作用对纳米颗粒吸附糖蛋白的影响。在此基础上分析洗脱液pH、洗脱温度、在洗脱液中加入单糖等因素单独或联合作用对糖蛋白洗脱的影响,确定糖蛋白洗脱的最佳条件。使用优化的最佳糖蛋白洗脱条件,利用硼酸功能化纳米颗粒分离纯化混合蛋白溶液中的糖蛋白。最后使用SDS-PAGE电泳分析不同温度响应性硼酸功能化化纳米颗粒对100倍稀释的鸡蛋蛋清中糖蛋白的吸附能力。结果:温度循环实验证明,通过简单地改变溶液温度,可以控制硼酸功能化纳米颗粒与混合样品中糖蛋白的结合与释放,且该结合-释放可以循环进行。果糖可与糖蛋白竞争硼酸功能化纳米颗粒上的硼酸位点,加入果糖可以减少纳米颗粒对糖蛋白的吸附量。将提高温度、使用酸性洗脱液与添加果糖联用,可以比单一条件更加有效地洗脱吸附于纳米颗粒上的糖蛋白,分离纯化糖蛋白与非糖蛋白混合样品中的糖蛋白。SDS-PAGE结果表明,温度响应性硼酸功能化纳米颗粒不仅可以分离纯化混合蛋白样品中的糖蛋白,还可以吸附鸡蛋清中的糖蛋白。结论:温度响应性硼酸功能化纳米颗粒可以用于控制糖蛋白的结合与释放。温度循环实验证明了硼酸-糖蛋白能够形成可逆的酯键;可以通过简单地改变温度来控制控制硼酸与糖蛋白的结合。改变温度的同时降低pH值并且添加果糖可以达到最好的糖蛋白回收效果。新型温度响应性硼酸功能化纳米颗粒不仅可以用于糖蛋白分离,还可以用于药物传递、药物缓释等。第四章基于点击化学的糖蛋白分子印迹聚合物的制备与评价目的:本章探索利用点击化学反应,在聚合物刷修饰的SiO_2纳米颗粒表面制备对模板糖蛋白糖基构成模式具有吸附特异性的糖蛋白分子印迹聚合物,提高对糖蛋白的吸附特异性。方法:(1)将炔基苯硼酸与模板糖蛋白(卵清蛋白)结合,得到炔基苯硼酸-卵清蛋白复合物。反应后透析去除未结合蛋白的炔基苯硼酸;(2)利用炔基-叠氮基的点击化学反应,将炔基苯硼酸-卵清蛋白复合物连接到SiO_2@PGMA-N_3@N_3,形成卵清蛋白-苯硼酸-纳米颗粒复合物;(3)洗脱卵清蛋白,得到可以特异性识别卵清蛋白表面特定糖基模式的SiO_2@MIP。非印迹对照颗粒SiO_2@NIP的制备除在第一步反应中不加入卵清蛋白外,其他步骤与SiO_2@MIP相同。对SiO_2@MIP与SiO_2@NIP进行电镜扫描、红外光谱分析、硼酸功能化分析,并评价其对卵清蛋白的吸附性能。结果:卵清蛋白印迹的硼酸功能化纳米颗粒SiO_2@MIP表面可以检测到硼酸基团,而SiO_2@NIP表面未检测到硼酸基团。SiO_2@MIP对卵清蛋白的吸附量显著大于对糖蛋白辣根过氧化物酶与非糖蛋白牛血清白蛋白的吸附量;SiO_2@NIP对各种蛋白的吸附量类似。SiO_2@MIP对卵清蛋白的最大吸附容量(Q_(max)=110.03 mg/g)显著大于SiO_2@NIP(Q_(max)=11.31 mg/g)。SiO_2@MIP对卵清蛋白的印迹因子(IF=8.12)显著高于牛血清白蛋白(IF=2.88),也高于表面糖基构成模式不同的辣根过氧化物酶(IF=5.17)。说明SiO_2@MIP可以特异性吸附模板蛋白卵清蛋白。SiO_2@MIP的特异性系数(K=1.73)高于第一章中所制备的硼酸功能化纳米颗粒SiO_2@PGMA-BA@BA(K=1.32),说明通过糖蛋白分子印迹方式制备硼酸功能化纳米颗粒可以提高特异性。结论:本方法利用点击化学反应,制备了对模板糖蛋白上特定糖基构成模式具有吸附特异性的糖蛋白MIP。这种创新性的蛋白印迹方法为制备糖蛋白MIP提供了新思路。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TB383.1
【文章目录】：
全文缩写词
摘要
Abstract
前言
第一章 硼酸功能化纳米颗粒的制备及性能评价
    1.1 前言
    1.2 材料和方法
        1.2.1 主要试剂、仪器和溶液的配置
        1.2.2 两种硼酸功能化纳米颗粒的制备和表征
        1.2.3 两种硼酸功能化纳米颗粒表面的硼酸化水平分析
        1.2.4 两种硼酸功能化纳米颗粒在水溶液中的分散性分析
        1.2.5 两种硼酸功能化纳米颗粒对糖蛋白的吸附性能评价
    1.3 结果和讨论
        1.3.1 两种硼酸功能化纳米颗粒的制备和表征
        1.3.2 两种硼酸功能化纳米颗粒表面的硼酸化水平分析
        1.3.3 两种硼酸功能化纳米颗粒在水溶液中的分散性分析
        1.3.4 硼酸功能化纳米颗粒结构和水溶液中分散性对其吸附糖蛋白性能的影响
    1.4 小结
第二章 温度响应性硼酸功能化纳米颗粒的制备及性能评价
    2.1 前言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 主要试剂、仪器和溶液的配置
        2.2.2 三种温度响应性硼酸功能化纳米颗粒的制备和表征
        2.2.3 三种温度响应性硼酸功能化纳米颗粒表面的硼酸化水平分析
        2.2.4 三种温度响应性硼酸功能化纳米颗粒在水溶液中的分散性分析
        2.2.5 三种温度响应性硼酸功能化纳米颗粒对糖蛋白的吸附性能评价
    2.3 结果和讨论
        2.3.1 三种温度响应性硼酸功能化纳米颗粒的制备和表征
        2.3.2 三种温度响应性硼酸功能化纳米颗粒表面的硼酸化水平分析
        2.3.3 三种温度响应性硼酸功能化纳米颗粒在水溶液中的分散性分析
        2.3.4 温度响应性硼酸功能化纳米颗粒结构和水溶液中分散性对其吸附糖蛋白性能的影响
    2.4 小结
第三章 温度响应性硼酸功能化纳米颗粒用于糖蛋白分离
    3.1 前言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 主要试剂、仪器和溶液的配置
        3.2.2 温度对硼酸功能化纳米颗粒吸附糖蛋白的影响
        3.2.3 温度与单糖联合作用对硼酸功能化纳米颗粒吸附糖蛋白的影响
        3.2.4 硼酸功能化纳米颗粒分离样品中糖蛋白的洗脱条件优化
        3.2.5 SDS-PAGE验证硼酸功能化纳米颗粒分离实际样品中糖蛋白的性能
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 温度控制硼酸功能化纳米颗粒吸附混合蛋白样品中的糖蛋白
        3.3.2 温度与单糖联合作用控制硼酸功能化纳米颗粒吸附混合蛋白样品中的糖蛋白
        3.3.3 硼酸功能化纳米颗粒分离样品中糖蛋白的洗脱条件优化
        3.3.4 硼酸功能化纳米颗粒分离混合蛋白样品中的糖蛋白
        3.3.5 硼酸功能化纳米颗粒吸附鸡蛋清中的糖蛋白
    3.4 小结
第四章 基于点击化学的糖蛋白分子印迹聚合物的制备与评价
    4.1 前言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 主要试剂、仪器和主要溶液的配置
        4.2.2 基于点击化学的糖蛋白MIP的制备
        4.2.3 糖蛋白MIP的表征
        4.2.4 吸附性评价
        4.2.5 统计学分析
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 基于点击化学的糖蛋白MIP的制备与表征
        4.3.2 吸附性评价
    4.4 小结
结论
创新点与局限性
参考文献
综述
    参考文献
附录
致谢

【参考文献】

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1 程华;李文强;石艳;周益平;方兰鑫;;分子刷聚合物环境响应特性及应用的研究进展[J];高分子通报;2015年12期

2 魏忠;侯华;;环境响应性聚合物刷的制备与应用[J];高分子通报;2012年05期

3 瞿亮,张国亮,张凤宝;聚合物刷的合成与应用研究进展[J];化学工业与工程;2005年06期

本文编号：2877690