脱碱基位点DNA分子信标和功能化纳米金簇的构建及生物应用研究

发布时间：2017-05-15 14:09

  本文关键词：脱碱基位点DNA分子信标和功能化纳米金簇的构建及生物应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本论文主要研究脱碱基位点DNA分子信标和功能化纳米金簇的构建及其生物应用。首先,本工作在DNA中设计嵌入脱碱基位点,通过改变DNA序列组装不同的分子信标,实现了对三聚氰胺和β淀粉样蛋白的选择性及灵敏检测。金纳米团簇具有毒性低且荧光性质稳定等特点,因而可作为药物输送的有效载体。通过对金纳米团簇的表面进行修饰,本工作实现了对siRNA的有效载送及释放,具有很好的临床治疗应用前景。本文的具体研究内容如下：第一章绪论本章首先分类介绍了分子信标,并详细阐述了它的生物分析应用。简单地介绍了脱碱基位点的合成方法以及它与小分子之间的结合。此外,链取代放大反应的原理与生物应用也在本章中作了重点介绍,而后还阐述了多种合成金纳米团簇的方法及其生物应用,最后对本论文的工作目的和意义做了表述。第二章基于含脱碱基位点(AP site)的三链分子信标对三聚氰胺的灵敏检测分析本工作基于三聚氰胺与胸腺嘧啶间的氢键作用及以碱基配对为基础的核酸分子识别功能,构建了含脱碱基位点的三链分子信标,用于对三聚氰胺的识别和定量检测。三聚氰胺为含氮量很高的常用工业原料,单独存在时毒性较低,然而与氰尿酸反应后会生成不溶物,因此食品和水源中过量的三聚氰胺会导致肾部结石并诱发膀胱癌,对动物和人体造成很大危害。因此,发展能够识别和定量检测三聚氰胺的有效方法变得尤为重要。本工作设计了能特异识别三聚氰胺的适配体,该适配体包括两端分别标记荧光基团和淬灭基团的长链DNA和嵌有脱碱基位点的短链DNA。三聚氰胺存在时,它可嵌入到短链DNA的脱碱基位点中,诱导两条单独的分子信标链形成特定的三链结构,引起荧光信号的改变,由此实现对三聚氰胺的识别和定量检测。通过优化分子信标的碱基数目、反应温度等,对三聚氰胺的检测限能够达到0.3μM。第三章‘基于含脱碱基位点的分子信标无酶循环放大策略用于DNA和β淀粉样蛋白的分析本工作将无标记的分子信标与循环放大策略相结合,实现了对DNA及Aβ低聚物简单及高选择性的检测。p淀粉样低聚物是p淀粉样蛋白(Aβ)聚集过程中产生的一种有毒物质,它可作为治疗阿尔茨海默症的潜在目标物。两种含脱碱基位点的发夹结构DNA链分别构成无标记的分子信标MB1和MB2,荧光分子2-amino-5,6,7-trimethyl-1,8-naph-thyridine (ATMND)通过氢键作用可嵌入到分子信标的脱碱基位点中,引起ATMND荧光的淬灭。加入目标DNA链后,该链可依次循环打开MB1和MB2,从而不断地释放荧光分子ATMND,因此,10 nM的目标DNA链便可产生明显的荧光增强的信号响应。将目标DNA链设计为Aβ低聚物的适配体序列,并重新设计相应的分子信标序列,可实现对Aβ低聚物的高选择性及定量检测,并可成功监测Ap由单体到低聚态再到纤维态的整个聚集过程。第四章阳离子化荧光金纳米簇载药体系的构建与表征本工作将毒性低且荧光性质稳定的金纳米团簇作为输送siRNA的有效载体,实现了体内siRNA的有效运输及释放。Small interfering RNA (siRNA)是一种小型RNA分子,具有抑制基因表达的特殊功能,因而是疾病治疗中最常使用的药物之一。传统的siRNA载药体系载送效率低,细胞毒性高且无法实现荧光成像,这使得基于siRNA的疾病治疗应用受到了限制。本课题为了克服传统载药体系的不足,发展了一种新型的荧光纳米载药体系。该体系将阳离子化的荧光金纳米簇(DMA/EDA-BSA-Au)作为载体,同时实现了荧光成像及诊断治疗。基于BSA的酸降解特性,该DMA/EDA-BSA-Au复合物输送siRNA的过程受到pH的调控。该载药体系可将siRNA输送到肺癌细胞中,引起GFP基因表达显著降低。因此,阳离子化的金纳米簇可作为输送siRNA的有效载体,在各种基于siRNA的疾病治疗中存在潜在的应用。
【关键词】：脱碱基位点 分子信标 循环放大 siRNA 金纳米团簇
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TB383.1
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 绪论13-34
• 第一节 分子信标概论13-19
• 1.1 分子信标简介13-17
• 1.2 分子信标的生物分析应用17-19
• 第二节 DNA脱碱基位点及其应用研究19-21
• 2.1 DNA脱碱基位点的形成19
• 2.2 DNA脱碱基位点性质19-21
• 第三节 链取代放大反应的原理及应用21-24
• 3.1 链取代放大反应(SDA)的原理21
• 3.2 链取代反应的生物应用21-24
• 第四节 金纳米团簇及其生物应用24-29
• 4.1 金属纳米团簇简介24
• 4.2 金纳米团簇的合成及其生物应用24-29
• 第五节 本论文的工作和意义29-30
• 参考文献30-34
• 第二章 基于含脱碱基位点(AP site)的三链分子信标对三聚氰胺的灵敏检测分析34-46
• 1 引言34-35
• 2 实验部分35-36
• 2.1 材料与试剂35-36
• 2.2 仪器与设备36
• 2.3 三聚氰胺检测实验36
• 3 结果与讨论36-43
• 3.1 三链分子信标的形成及检测三聚氰胺实验原理36-37
• 3.2 条件优化37-40
• 3.3 分子信标的表征40-41
• 3.4 三聚氰胺的检测41-43
• 4 结论43-44
• 参考文献44-46
• 第三章 基于含脱碱基位点的分子信标无酶循环放大策略用于DNA和β淀粉样蛋白的分析46-61
• 1 引言46-47
• 2 实验部分47-49
• 2.1 材料与试剂47-48
• 2.2 仪器与设备48
• 2.3 低聚态及纤维态Aβ的制备48-49
• 2.4 无酶放大检测实验49
• 3 结果与讨论49-58
• 3.1 无标记及无酶放大检测实验原理49-50
• 3.2 无需标记的含AP位点的分子信标体系50-51
• 3.3 无需酶的放大反应51-53
• 3.4 特异性研究53-54
• 3.5 Aβ低聚物的测定54-57
• 3.6 监测Aβ的聚集过程57-58
• 4 结论58-59
• 参考文献59-61
• 第四章 阳离子化荧光金纳米簇载药体系的构建与表征61-74
• 1 引言61-62
• 2 实验部分62-64
• 2.1 材料与试剂63
• 2.2 金纳米簇的合成63
• 2.3 金纳米簇的阳离子化63
• 2.4 粒子尺寸及表面电荷测量63-64
• 2.5 电泳分析64
• 2.6 细胞培养64
• 2.7 体外细胞摄取复合物及其分布实验64
• 3 结果与讨论64-71
• 3.1 DMA/EDA-BSA-Au复合物的合成及siRNA负载原理64-65
• 3.2 DMA/EDA-BSA-Au复合物的表征65-69
• 3.3 细胞对siRNA/GNC复合物的摄取及分布研究69-70
• 3.4 GFP基因敲除研究70-71
• 4 结论71-72
• 参考文献72-74
• 附录：硕士期间发表论文情况74-75
• 致谢75

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本文编号：367970