β-环糊精修饰的树状大分子包裹纳米金颗粒用于基因传递的研究

发布时间：2017-05-17 06:04

  本文关键词：β-环糊精修饰的树状大分子包裹纳米金颗粒用于基因传递的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：基因治疗作为一种现代医学和分子生物学相结合而诞生的新技术,是通过将外源正常基因导入靶细胞内,用以纠正或补偿基因缺失或异常引起的疾病,从而进行疾病治疗。然而,目前基因治疗最主要的障碍就是缺乏一种安全有效的传递表达载体。在基因载体系统中,主要借助病毒和非病毒载体将外源基因导入靶细胞。病毒载体由于其高效的转染效率而被应用于临床上的基因治疗,但由于发现了其很多安全隐患因此进一步的广泛应用受到了制约。而非病毒载体,由于其低细胞毒性、无免疫原性、易操作和高基因装载量等特点,越来越受到研究者们的关注。非病毒载体中,PAMAM聚酰胺胺树状大分子是目前研究最深入的树状大分子之一,它在保有树状大分子共性的同时又兼具自身的特性,因而受到了研究者们的广泛关注。研究表明,PAMAM树状大分子的基因转染效率和细胞毒性会随着其代数的增加而增加。第一至四代的PAMAM毒性比较小,但基因转染率却很低;第五代以上的PAMAM大分子毒性较大,但基因转染效率明显提高。而第五代(G5)PAMAM树状大分子虽然有一定的毒性,但可以通过进行表面修饰以减少表面的氨基基团数目,从而降低表面毒性,同时又保有较好的转染能力。因此G5 PAMAM树状大分子已经作为非病毒载体应用于基因传递,然而其高细胞毒性与低基因转染效率限制了其在基因治疗方面的应用。为了提高其作为基因传递载体的性能,我们先将b-环糊精(β-CD)修饰到G5 PAMAM树状大分子表面,然后将其作为模板以1:25的树状大分子/金盐摩尔比包裹金纳米颗粒。在本课题的研究中,我们通过核磁共振氢谱(~1H NMR),紫外可见光谱(UV-vis)和透射电子显微镜(TEM)表征了所合成的β-CD修饰的树状大分子包裹纳米金颗粒复合物(Au DENPs-β-CD)的物化性能;使用凝胶阻滞实验、Zeta电势实验和动态光散射实验测定Au DENPs-β-CD复合物在不同N/P比下对基因的压缩能力;材料的生物相容性则使用MTT实验测试。随后则用两种不同的报告pDNA(荧光酶Luc基因和增强型绿色荧光蛋白EGFP基因)以及两种不同si RNA(B淋巴细胞瘤-2基因Bcl-2和血管内皮生长因子VEGF)分别在293T细胞和恶性胶质瘤细胞U87MG细胞内验证材料作为载体应用在传递基因方面的能力。结果显示Au DENPs-β-CD可以在低N/P时完全包裹pDNA(N/P=0.5时)及siRNA(N/P=2时),与未修饰β-CD的Au DENPs相比显现出较低的细胞毒性与高效的基因传递效率。因其优越的基因压缩能力、低细胞毒性及高基因转染效率,我们期待Au DENPs-β-CD能成为一种新的安全有效的非病毒载体应用于基因治疗。
【关键词】：聚酰胺胺树状大分子 β-环糊精 纳米金颗粒 基因传递
【学位授予单位】：东华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R440;TB383.1
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 绪论12-23
• 1.1 基因治疗（Gene Therapy）12-14
• 1.1.1 基因治疗简介12
• 1.1.2 基因治疗常用方法12-13
• 1.1.3 基因治疗载体系统13-14
• 1.2 RNA干扰（RNA Interfering）14-16
• 1.2.1 RNA干扰简介14-15
• 1.2.2 RNA干扰的研究历史15
• 1.2.3 RNA干扰的主要研究方向15-16
• 1.2.4 RNA干扰所亟需解决的问题16
• 1.3 阳离子聚合物载体PAMAM16-19
• 1.3.1 树状大分子简介16-17
• 1.3.2 PAMAM简介17-18
• 1.3.3 PAMAM基因治疗方面应用18
• 1.3.4 PAMAM在siRNA基因方面的应用18-19
• 1.4 β-环糊精（β-CD）19
• 1.4.1 环糊精（CDs）简介19
• 1.4.2 β-环糊精（β-CD）基因治疗方面的应用19
• 1.5 树状大分子包裹的纳米金颗粒（Au DENPs）19-21
• 1.5.1 纳米金属颗粒简介19-20
• 1.5.2 树状大分子包裹的金属纳米颗粒20
• 1.5.3 树状大分子包裹的纳米金颗粒基因治疗方面的应用20-21
• 1.6 本论文研究的内容及创新点21-23
• 1.6.1 研究内容21-22
• 1.6.2 课题创新点22-23
• 第二章 β-CD修饰树状大分子包裹纳米金颗粒Au DENPs-β-CD的合成与表征23-29
• 2.1 引言23
• 2.2 实验材料与设备23-24
• 2.2.1 药品和试剂23-24
• 2.2.2 主要仪器24
• 2.3 实验方法24-25
• 2.3.1 G5.NH_2-β-CD的合成24
• 2.3.2 Au DENPs-β-CD的合成24
• 2.3.3 G5.NH_2-β-CD的表征24-25
• 2.3.4 Au DENPs-β-CD的表征25
• 2.4 实验结果与讨论25-28
• 2.4.1 ~1H NMR核磁氢谱26
• 2.4.2 紫外可见光谱26-27
• 2.4.3 末端氨基定氮27-28
• 2.4.4 透射电子显微镜（TEM）28
• 2.5 小结28-29
• 第三章 Au DENPs-β-CD载体/基因复合物的制备与表征29-40
• 3.1 引言29-30
• 3.2 实验材料与设备30-31
• 3.2.1 药品和试剂30
• 3.2.2 主要仪器30-31
• 3.3 实验方法31-34
• 3.3.1 质粒的提取31-32
• 3.3.2 质粒的定量32
• 3.3.3 质粒的标记32-33
• 3.3.4 各载体/pDNA复合物的制备与表征33
• 3.3.5 各载体/siRNA复合物的制备与表征33-34
• 3.4 实验结论34-39
• 3.4.1 质粒的提取34
• 3.4.2 各载体/pDNA复合物的制备与表征34-36
• 3.4.3 各载体/siRNA复合物的制备与表征36-39
• 3.5 小结39-40
• 第四章 Au DENPs-β-CD载体/基因复合物转染效率实验40-58
• 4.1 引言40
• 4.2 实验材料与设备40-42
• 4.2.1 药品和试剂40-41
• 4.2.2 主要仪器41-42
• 4.3 实验方法42-48
• 4.3.1 各载体/pDNA复合物转染效率实验42-43
• 4.3.2 各载体/siRNA复合物转染效率实验43-48
• 4.4 实验结论48-57
• 4.4.1 各载体/pDNA复合物转染效率实验48-53
• 4.4.2 各载体/siRNA复合物转染效率实验53-57
• 4.5 小结57-58
• 第五章 结论与展望58-59
• 参考文献59-65
• 攻读硕士期间发表论文65-66
• 致谢66

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