阳离子聚合物修饰的硅纳米线阵列在基因转染中的应用

发布时间：2017-08-21 08:24

  本文关键词：阳离子聚合物修饰的硅纳米线阵列在基因转染中的应用

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【摘要】：基因转染可用于治疗或缓解多种疾病,已成为基础和临床研究中不可缺少的医疗手段。基因转染的关键问题在于选择安全高效的基因载体和转染方法,将核酸物质直接运输到细胞核内并高效表达,这也是目前基因转染技术的瓶颈所在。非病毒型高分子化合物作为基因载体可以在一定程度上提高基因转染的效率和安全性,其中阳离子聚合物具有易于合成、便于改性且可携带较多DNA进入细胞等优点,被广泛用作基因转染的基因载体。然而阳离子聚合物很难辅助DNA直接进入细胞核,转染效率无法进一步提高。同时,阳离子聚合物在细胞内易大量累积并干扰细胞的正常代谢过程而产生细胞毒性。这些缺点极大地限制了阳离子聚合物在临床上的应用。硅纳米线阵列(SN)可以在保持细胞活性的同时刺穿细胞膜甚至细胞核膜,携带诸多生物因子进入细胞乃至细胞核。且SN具有较好生物相容性,可支持多种细胞的培养。然而,由于未经修饰的SN表面存在硅的氧化层,因此导致DNA负载量较低,限制了其在基因转染领域的应用。本论文提出了构建以阳离子聚合物修饰的硅纳米线阵列作为基因转染的材料平台并辅以提高负载量和促进表达等手段的复合基因转染系统策略,旨在综合利用硅纳米线对细胞核的直接刺穿作用和阳离子聚合物载体对核酸的有效结合与释放作用,来提高基因转染的效率并尽可能地降低细胞毒性。具体研究内容如下:首先,构建了一系列核酸载体阳离子聚合物修饰的硅纳米线阵列。通过化学修饰的方法将25 kDa的支化聚乙烯亚胺(PEI)和聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(PDMAEMA)接枝到硅纳米线阵列表面得到PEI修饰的硅纳米线阵列(SN-PEI)和PDMAEMA修饰的硅纳米线阵列(SN-PDM);为进一步发挥DNA的负载和释放效果及细胞在材料表面的黏附及脱附,在SN-PDM中引入聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)链段获得聚(N-异丙基丙烯酰胺-甲基丙烯酸氨基乙酯)(PNIPAAmco-PDM)修饰的硅纳米线阵列(SN-PNIPAAm-PDM)。借助水接触角测试、扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)等手段确定了聚合物的成功接枝并系统地表征了材料的表面特性。同时进一步深入考察了这三种基因转染的材料平台对细胞生长的影响,结果发现SN-PEI和SN-PDM表面能黏附较多的细胞并实现细胞的良好铺展和增殖,表明pei和pdmaema对sn的修饰能够有效提高材料的生物相容性,具有被进一步用作基因转染材料平台的潜力和优势。而sn-pnipaam-pdm表面无法维持细胞的正常活性,生物相容性较差,不适合被用作转染材料。在此基础上,我们提出了由高效核酸结合型载体聚乙烯亚胺(pei)接枝修饰的硅纳米线阵列(sn-pei)作为基因转染材料平台,并辅以生物相容性较好的小分子量pei与dna的复合物的转染体系策略以提高dna在材料表面上的负载量从而促进基因转染效率和安全性。探讨并系统地考察了sn-pei表面氨基密度、dna在材料表面孵育时间以及转染复合物中小分子pei与dna的n/p比(pei中的氮原子与dna中磷原子的摩尔比)对基因转染效率的影响。结果发现将n/p比为80的小分子pei(2kda)与dna的混合物孵育在25kdapei接枝时间为3h的sn-pei表面10min后,体系可实现最大的转染效率。这一策略有效地提高了基因的转染效率并降低了转染体系的细胞毒性,然而仍存在一些问题亟需解决,如高分子量pei可能存在潜在的细胞毒性、体系中dna的负载量较低还需补加小分子量pei与dna的复合物。为构建更加高效和安全的基因转染体系,有效提高基因在进入细胞核后的表达,我们进一步提出了以pdmaema修饰的硅纳米线阵列为材料平台,辅以传统的钙离子依赖型转染体系的集成策略,以充分利用材料平台和钙离子依赖型转染体系的优点,获得安全、高效负载和高量表达的基因转染途径。pdmaema具有比pei更好的生物相容性,传统钙离子依赖型转染体系能够有效促进dna的胞内释放和表达。研究结果表明当钙离子浓度为100mm、钙离子与dna的复合物在sn-pdm表面的孵育时间与为20min,pdmaema聚合时间为24h的sn-pdm能够实现基因高效率的转染和表达。这个集成策略为基因传递提供了一种崭新的思路,有望在医学研究和临床治疗中进一步广泛应用。综上所述,在生物相容性好且能够直接作用于细胞核的硅纳米线阵列表面引入高效的基因载体阳离子聚合物pei与pdmaema构建的阳离子聚合物修饰的硅纳米线阵列是基因转染的有效的材料平台,这种平台不仅能够支持细胞的黏附和正常生长增殖,同时能够包容多种传统的、安全的基因转染方法,最终实现高效的,集成的,安全的基因转染和表达。这种以阳离子聚合物修饰的硅纳米线阵列为材料平台的复合基因转染体系有望为构建新型基因转染材料和药物输送体系提供高效的平台和崭新的思路。
【关键词】：阳离子聚合物 硅纳米线阵列 表面修饰 生物相容性 基因转染
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TB383.1;R450
【目录】：

• 摘要4-7
• abstract7-14
• 第一章 绪论14-29
• 1.1 基因治疗概述14-15
• 1.2 基因转染载体15-24
• 1.3 表面辅助基因转染24-26
• 1.4 课题的提出26-29
• 第二章 功能化硅纳米线阵列对细胞生长影响的研究29-53
• 2.1 引言29-30
• 2.2 实验部分30-42
• 2.2.1 实验试剂及耗材30-32
• 2.2.2 溶液配制32
• 2.2.3 实验仪器32-33
• 2.2.4 硅纳米线阵列的制备33-34
• 2.2.5 PEI修饰的硅纳米线阵列的制备34-37
• 2.2.6 PDMAEMA修饰的硅纳米线阵列的制备37-38
• 2.2.7 PNIPAAm-co-PDM修饰的硅纳米线阵列的制备38-39
• 2.2.8 材料的生物相容性39-42
• 2.3 结果及讨论42-52
• 2.3.1 PEI修饰的硅纳米线阵列的表征42-46
• 2.3.2 PDMAEMA修饰的硅纳米线阵列的表征46-48
• 2.3.3 PNIPAAm-co-PDM修饰的硅纳米线阵列的表征48-49
• 2.3.4 功能化硅纳米线阵列对细胞生长的影响49-52
• 2.4 本章小结52-53
• 第三章 PEI修饰的硅纳米线阵列用于基因转染53-72
• 3.1 引言53-54
• 3.2 实验部分54-59
• 3.2.1 实验试剂及耗材54-56
• 3.2.2 相关试剂的配制56-58
• 3.2.3 实验仪器58-59
• 3.3 实验步骤59-64
• 3.3.1 质粒DNA的提取及纯化59-60
• 3.3.2 细胞培养60-61
• 3.3.3 PEI接枝的硅纳米线阵列61-63
• 3.3.4 基因转染实验63-64
• 3.3.5 添加小分子PEI与DNA复合物的转染实验64
• 3.4 结果与讨论64-71
• 3.4.1 质粒pRL-CMV的提取结果64-65
• 3.4.2 PEI修饰的硅纳米线阵列用于基因转染65-67
• 3.4.3 PEI修饰的硅纳米线阵列与外源的小分子量PEI-DNA复合物协同作用对基因转染效率的影响67-69
• 3.4.4 影响基因转染体系效率的因素69-71
• 3.5 本章小结71-72
• 第四章 PDMAEMA修饰的硅纳米线阵列用于基因转染72-86
• 4.1 引言72-74
• 4.2 实验步骤74-77
• 4.2.1 试剂及耗材74-75
• 4.2.2 溶液配制75-76
• 4.2.3 实验仪器76-77
• 4.3 实验步骤77-79
• 4.4 实验结果及讨论79-85
• 4.4.1 SN-PDM表面性质表征79-81
• 4.4.2 PDMAEMA修饰的硅纳米线阵列用于基因转染81-82
• 4.4.3 影响转染体系效率的因素82-85
• 4.5 本章小结85-86
• 第五章 结论与展望86-88
• 5.1 结论86-87
• 5.2 展望87-88
• 参考文献88-104
• 硕士论文工作期间科研成果104-105
• 致谢105-107

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