去甲肾上腺素功能化PDMS微芯片在生物样品分离中的应用研究

发布时间：2017-09-26 03:28

  本文关键词：去甲肾上腺素功能化PDMS微芯片在生物样品分离中的应用研究

  更多相关文章： PDMS芯片 聚去甲肾上腺素 磁性分子印迹聚合物 手性物质拆分 蛋白质激酶A

【摘要】：微芯片电泳起源于上世纪90年代初期,它首次运用微加工技术,在玻璃、硅片、石英和一些高分子聚物等原材料上加工制作出了用于电泳分离的微通道。由于离子或分子与固定相之间的电迁移或分配行为上的不同,借助于电场力的作用,在平方厘米大小的芯片上,可以实现分析样本从进样、反应、分离和检测等过程。由于该分析方法具有操作简单、耗时短、试剂使用量较少、通量高、易于微型化等优点,它俨然已成为了生化分析中一个重要研究领域。但是在常用的一些芯片制备的原材料中,聚二甲基硅氧烷芯片(PDMS)自身存在一些不可避免的缺点:如表面固有的疏水性,电渗流稳定性差、易吸附被测组分,导致分离分析效率降低;导热性差,制约了高分离电压的运用等缺点。这就限制了其在生物样品分析检测领域的使用。进而寻找新的涂层材料以及制备新型固定相对PDMS表面修饰改性,对生物样品的分离分析就成为我们亟待解决的问题。去甲肾上腺素(NE)是一种类多巴胺的儿茶酚胺类小分子,在弱碱性条件下即可自聚合生成聚去甲肾上腺素(PNE)而粘附在几乎所有材料的表面。利用其在弱碱性条件下的自聚合作用及良好的成膜性,建立了一种对PDMS微流控芯片通道的简单、绿色的修饰方法。经聚去甲肾上腺素(PNE)功能化的PDMS芯片通道,不仅亲水性得到极大改善,还获得了稳定的电渗流,这就为在功能化的PDMS芯片上拆分不同类型生物分子开辟了一条林荫大道。本文用PNE对PDMS微芯片内通道进行修饰改性,并应用于生物分析样本的分离分析,以此为基础我们开展了以下几个方面的工作:1.利用去甲肾上腺素在弱碱性条件下的自聚合作用及良好的成膜性,建立了一种对聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片通道的简单、绿色的表面修饰方法。经聚去甲肾上腺素(PNE)功能化的PDMS芯片通道,在PDMS芯片充满去甲肾上腺素(NE)溶液后,在溶液中氧化逐渐形成聚去甲肾上腺素膜并沉积在微通道内壁作为永久涂层,由于拥有丰富的儿茶酚和胺官能团,经PNE涂层修饰的PDMS表面具有更好的润湿性,可以获得更加稳定的电渗流和更少的非特异性吸附。与未修饰的PDMS相比较,经过测量其接触角和电渗流分别为108°和2.24×10-4 cm2 V-1 s-1,而经过PNE修饰的PDMS芯片,其接触角和电渗流分别降低为13°和1.68×10-4 cm2 V-1 s-1。经过耦合柱内安培检测技术,在有效分离长度为37 mm的PNE修饰后的PDMS芯片通道内,不同种类的手性化合物,例如手性氨基酸,手性药物,手性多肽等,可以成功达到基线分离。这种巧妙的基于PNE修饰的芯片体系,展现了强效的手性识别能力,非常好的重现性和稳定性,这些性能使得其在复杂生物样品的分析中展现出了更大的潜力。2.提出了一种基于磁性分子印迹技术,在PDMS芯片通道内用于多种物质同时检测。首先,在弱碱性条件下,以Fe_3O_4 NPs为支撑载体,以NE做功能单体,在存在目标分子L-色氨酸条件下,利用NE自聚合生成一层稳定的、亲水性的PNE涂层,其可将模板分子L-色氨酸镶嵌于Fe_3O_4@PNE NPs的表面,通过使用洗脱剂十二烷基磺酸钠-醋酸,将模板分子洗脱出来,制备出与模板分子相匹配的三维空腔的分子印迹聚合物(MIP-Fe_3O_4@PNE NPs),然后将其磁性固定于芯片通道内,成功用于D/L-色氨酸手性对映体拆分。类似的我们制备了相对应于单个的不同的模板分子的分子印迹聚合物MIP-Fe_3O_4@PNE NPs,如分别以L-缬氨酸,L-苏氨酸,甘氨酸-L-苯丙氨酸,S-(-)-联萘酚和S-(-)-氧氟沙星作为模板分子,并磁性固定于通道内成功拆分了相对映的各种对映体。更重要的是,将单独印迹了相对应的模板分子的分子印迹聚合物混合,固定于通道内做固定相,在同一通道内的不同类型的几对对映体也可同时达到基线分离。3.以Fe_3O_4磁性微球为载体,利用去甲肾上腺素在弱碱性溶液中的自聚合作用,在Fe_3O_4磁性微球表面形成聚去甲肾上腺素(PNE)。制备的Fe_3O_4@PNE磁性纳米微球,一方面具有良好的磁性,使其在外磁场作用下即可简单地固定于PDMS通道内;另一方面,PNE中的儿茶酚羟基可以与Ti~(4+)螯合,而将Ti~(4+)固定在Fe_3O_4@PNE功能化PDMS通道内。当蛋白质激酶A(PKA)存在时,PKA催化ATP将磷酸根转移到底物多肽上,进而与固定于通道内的Ti~(4+)结合,而未磷酸化的多肽则不与Ti~(4+)发生作用,以此达到磷酸化多肽与未磷酸化多肽的分离,并据此实现PKA的快速和灵敏检测。
【关键词】：PDMS芯片 聚去甲肾上腺素 磁性分子印迹聚合物 手性物质拆分 蛋白质激酶A
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TN492
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 第1章 引言11-24
• 1.1 芯片毛细管电泳简述11-12
• 1.2 芯片毛细管电泳的理论研究12-13
• 1.2.1 电渗流(EOF)12-13
• 1.2.2 分离度的计算13
• 1.3 微流控芯片技术13-22
• 1.3.1 芯片取材和加工技术14-17
• 1.3.1.1 芯片的取材14-15
• 1.3.1.2 芯片的加工技术15-17
• 1.3.2 微流体的控制和驱动技术17
• 1.3.3 微芯片毛细管电泳检测技术17-19
• 1.3.3.1 光学检测器18-19
• 1.3.3.2 电化学检测器19
• 1.3.3.3 质谱检测器19
• 1.3.4 微流控芯片电泳在生物医学方面的应用研究19-22
• 1.3.4.1 细胞分析19-20
• 1.3.4.2 生物分子分离20-21
• 1.3.4.2 蛋白质分析21
• 1.3.4.3 免疫分析21-22
• 1.4 本课题的提出22-24
• 第2章 基于聚去甲肾上腺素涂层的PDMS用于手性化合物的分离24-37
• 2.1 引言24-27
• 2.2 实验部分27-29
• 2.2.1 化学试剂和表征27-28
• 2.2.2 PDMS芯片的构造28
• 2.2.3 电渗流的测定28-29
• 2.2.4 PNE功能化PDMS芯片的制备29
• 2.2.5 手性分离和检测过程29
• 2.3 结果与讨论29-36
• 2.3.1 PNE功能化的PDMS芯片的表征29-31
• 2.3.2 PNE修饰PDMS芯片的电渗流31-32
• 2.3.3 手性拆分条件的优化32-33
• 2.3.4 手性化合物的手性拆分33-34
• 2.3.5 定量检测、再现性和稳定性34-35
• 2.3.6 在复杂生物样品中苯丙氨酸试验分析35-36
• 2.4 结论36-37
• 第3章 基于磁性分子印迹聚合物的手性物质识别研究37-55
• 3.1 引言37-39
• 3.2 材料与方法39-43
• 3.2.1 PDMS微流控芯片的制备40-41
• 3.2.2 MIP-Fe_3O_4@PNE NPs的合成41
• 3.2.3 MIP-Fe_3O_4@PNE NPs填充微芯片的制备41-42
• 3.2.4 用于手性分离的设备42-43
• 3.2.5 分离原理43
• 3.3 结果与讨论43-53
• 3.3.1 Fe_3O_4@PNE NPs的特征43-47
• 3.3.2 Fe_3O_4@PNE NPs填充PDMS微芯片的电渗流47
• 3.3.3 分析物的电化学行为47-48
• 3.3.4 印迹变量和分离条件的优化48-50
• 3.3.5 手性化合物的拆分50-53
• 3.4 系统的定量评价和重现性53-54
• 3.5 结论54-55
• 第4章 磁性功能化PDMS通道的蛋白激酶活性分析方法55-67
• 4.1 引言55-57
• 4.2 实验部分57-59
• 4.2.1 实验过程中所使用的试剂和主要仪器57-58
• 4.2.2 Fe_3O_4磁性纳米粒子的合成58
• 4.2.3 Fe_3O_4@PNE磁性纳米粒子的合成58
• 4.2.4 Fe_3O_4@PNE-Ti~(4+) NPs对PDMS微芯片的修饰58-59
• 4.2.5 细胞裂解液和样品的制备59
• 4.2.6 手性分离和检测过程59
• 4.3 结果与讨论59-65
• 4.3.1 Fe_3O_4@PNE-Ti~(4+) NPs的特征59-61
• 4.3.2 实验条件的优化61-62
• 4.3.3 多肽样品的分离62-63
• 4.3.4 对Fe_3O_4@PNE-Ti~(4+) NPs填充PDMS微芯片的电渗流性能研究63-64
• 4.3.5 PKA活性分析64-65
• 4.3.6 复杂生物样品中分析PKA活性65
• 4.4 结论65-67
• 展望67-68
• 致谢68-69
• 参考文献69-80
• 攻读学位期间的研究成果80

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