一株海绵共生芽孢杆菌的抗硅藻附着活性物质的分离与鉴定

发布时间：2018-01-02 05:16

本文关键词：一株海绵共生芽孢杆菌的抗硅藻附着活性物质的分离与鉴定　出处：《扬州大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：海洋微生物由于其特殊的海洋生存环境,能产生结构新颖且活性多样的代谢产物,从其中寻求具有特异活性的天然产物是开发海洋资源的重要研究方向。海洋生物污损是一直是困扰人类的棘手难题,现行的防污措施都只是临时寻找对环境危害相对较小的化合物进行防治,没有从根本上解决问题。开发高效、无毒、环境友好的活性化合物,是目前国内外公认解决途径。越来越多的证据表明,海绵独特的防污损化学机制,很有可能来源于其共附生的微生物。因此,从海绵共附生微生物中寻找天然抗污损活性物质,是解决海洋生物污损的重要且可行的方案。本研究针对一株海绵共附生细菌UST050418-715菌株,进行了抗硅藻附着活性的测定、菌种鉴定、发酵条件优化、细菌发酵、活性指导下的活性化合物分离和结构鉴定。结果如下：(1)试验菌株的筛选与菌种鉴定实验室前期工作已经筛选出有抗硅藻附着活性的海绵共附生细菌,选取其中4株：UST050418-315、UST050418-69、UST050418-708和UST050418-715,进行三种硅藻(小新月菱形藻、、咖啡双眉藻、碎片菱形藻)的活性验证。结果表明,这4株测试细菌均对三种附着硅藻(小新月菱形藻(Nitzschia closterium)、咖啡双眉藻(Amphora cofeaeformis)和碎片菱形藻(Nitzschia frustulum))有明显的抑制作用,平均抑制率都超过90%。其中菌株UST050418-715对三种附着硅藻都有较强的抑制附着作用,对测试硅藻的抑制率均≥90%,平均抑制率达92.1%,因此选定试验菌株为UST050418-715。通过16S rDNA的测序分析,结合平板的菌落形态和扫描电镜下菌体特征,鉴定菌株UST050418-715为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。(2)菌株UST050418-715发酵条件优化针对菌株UST050418-715进行了四因素三水平的正交试验,发现这四种因素对发酵结果影响从大到小的顺序依次：酵母粉蛋白胨NaClpH。通过正交试验,结合菌株发酵粗提物活性、粗提物产量和菌株生长情况进行综合分析,发现各发酵条件对活性物质产量有极显著的影响,因此结合三个指标测定结果确定了菌株UST050418-715的最佳发酵条件为：蛋白胨浓度为7.5 g/L,酵母粉浓度为3 g/L,NaCl浓度为10.45 g/L,pH 9.5。(3)菌株UST050418-715活性物质的分离和结构鉴定对菌株UST050418-715进行发酵,积累粗提物。以抗硅藻附着的活性为导向,对粗提物进行逐步的分离纯化和结构鉴定。分离步骤：1)初步分离：用不同溶剂萃取将粗提物按照极性大小分为5个组分,石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相,分别记为Fr-1～Fr-5.用显微计数测定5个组分的抗硅藻附着活性,HPLC分析各组分,其中二氯甲烷相(Fr-2)活性最好,乙酸乙酯相极性适中易于分离。2)半制备色谱分离：用恒定40%的甲醇作流动相洗脱分离Fr-3,得到Fr-3.1～Fr-3.7,其中Fr-3.2*、Fr-3.5*、Fr-3.6、Fr-3.7*较纯,Fr-3.3活性较好。用40%的甲醇洗脱Fr-2进行半制备HPLC分离,得到Fr-2.1-Fr-2.8,其中Fr-2.1、Fr-2.3*、Fr.2.5*较纯,Fr-2.4、Fr-2.6、Fr-2.7、Fr-8有较好的活性。3)半制备HPLC进一步分离：对活性较好的组分：Fr-3.3、Fr-2.4、Fr-2.6和Fr-2.7进一步的半制备HPLC分离,得到Fr-3.3.1～Fr-3.3.8。Fr-2.4.1～Fr.2、4.6、Fr-2.6.1～Fr-2.6.6和Fr-2.7.1～Fr.2.7.3.进一步分离Fr-2.6.2,得到Fr.2.6.2.1～Fr-2.6.2.4.通过以上分离,选取较纯或活性较好的34个组分进行GC-MS分析,其中12个组分较纯,对其进行1H-NMR分析。通过GC-MS的分子质量分析和1H-NMR分析,可以鉴定出Fr-2.3*、Fr-2.4.2和Fr-3.5*的主要成分为同种物质,环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)[Cyclo(L-Leu-L-Pro)],其抑制率分别为12.7%±8.4%、28.5%±3.5%和30.7%±5.0%；Fr-2.4.3的平面结构为环(缬氨酸-脯氨酸)[Cyclo(Val-Pro)],其抑制率为28.0%±10.4%；Fr-2.6.5为坏(D-脯氨酸-L-亮氨酸)[Cyclo(D-Pro-L-Leu)],其抑制率为28.0%±12.6%;Fr-2.7.1为环(L-脯氨酸-D-亮氨酸)[Cyclo-(L-Pro-D-Leu)],其抑制率为18.0%±2.8%；Fr-3.2*为环(甘氨酸-D-脯氨酸)[Cyclo-(Gly-D-Pro)],其抑制率为46.3%±10.8%;Fr-3.6为环(4R-D-羟脯氨酸-L-苯丙氨酸)[Cyclo(4R-D-Hydroxypro-L-Phe)],其抑制率为28.7%±11.3%；Fr-3.7*为环(4R-L-羟脯氨酸-L-苯丙氨酸)[Cyclo(4R-L-Hydroxypro-L-Phe)],其抑制率为11%±5.5%。
[Abstract]:In order to solve the problem of marine biological fouling , we have selected four strains : UST050418 - 315 , UST050418 - 69 , UST050418 - 708 and UST050418 - 715 . ( 2 ) The optimal fermentation conditions of strain UST050418 - 715 were optimized for strain UST050418 - 715 . The results showed that the optimum fermentation conditions were : peptone concentration 7.5 g / L , yeast powder concentration 3 g / L , NaCl concentration 10.45 g / L and pH 9.5 . ( 3 ) Separation and structure identification of the active substances of the strains UST050418 - 715 were carried out on the strains UST050418 - 715 . The crude extracts were separated and purified by HPLC .

【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X55;X172

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