海洋细菌Ponticoccus sp. PD-2群体感应系统及对抑藻功能的调控探究

发布时间：2018-07-16 20:38

【摘要】：海洋环境中的溶藻细菌是一类对海洋微藻的生长具有抑制作用,或直接杀死藻细胞的细菌。研究溶藻细菌的功能与机制是藻菌作用关系的热点问题,对探讨赤潮的生物治理等关键科学问题具有重要的指导意义。本文以一株微藻共栖细菌Ponticoccus sp.PD-2为研究对象,研究了其群体感应系统,利用CRISPR/CAS9技术成功敲除群体感应基因zlaI和zlbI,探明了其抑藻活性和群体感应之间的联系,主要研究内容包括:本文对PD-2的基因组序列进行分析,发现了两对群体感应基因(luxI/R同源基因),命名为zlaI/R和zlbI/R。通过构建系统发育树和多重蛋白序列比对分析,发现这两对群体感应调控蛋白与其他菌种对应蛋白的同源性较高,高于69%,且luxI同源蛋白的氨基酸序列高度保守。利用生物传感器和GC-MS检测PD-2产生的AHLs信号分子的数量和种类,发现该菌至少可以产生两种AHLs分子,分别为OC8-HSL和OC10-HSL。分别克隆zlaI和zlbI基因并连接表达栽体pGEX-6P-1,在大肠杆菌E.scherichia coli BL21中高效异源表达,生物自显影的方法证实两个luxI同源基因均能合成OC8-HSL和OC10-HSL两种信号分子,其中OC8-HSL主要由zlbI调控合成。本文通过抑藻实验发现,PD-2的代谢产物对三种赤潮藻(东海原甲藻,棕囊藻,塔玛亚历山大藻)的生长有明显的抑制作用,对其宿主东海原甲藻的抑制作用最强。我们通过向PD-2培养液中加入AHLs信号分子抑制剂β-环糊精后,发现PD-2信号分子的含量明显减少。通过抑藻实验发现,AHLs信号分子减少后PD-2的藻活性也降低了50%-80%,说明淬灭QS系统后可以影响PD-2中抑藻物质的产生。本论文利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,成功敲除了PD-2中的两个AHLs合成酶基因zlaI和zlbI,实现了CRISPR/CAS9在海洋细菌中的应用。后对PD-2zlaI和zlbI缺失突变体进行了AHLs分子及抑藻活性检测,实验结果表明敲除luxI同源基因的PD-2不再产生AHLs信号分子,同时其抑藻功能消失,该结果进一步从分子水平证明了PD-2的抑藻活性受群体感应系统的调控。
[Abstract]:Algae-lysing bacteria in marine environment are a kind of bacteria which can inhibit the growth of marine microalgae or kill the algal cells directly. The study of the function and mechanism of algae-lysing bacteria is a hot issue in the relationship between algal bacteria and algal bacteria. It is of great significance to discuss the key scientific issues such as the biological treatment of red tide. In this paper, the colony sensing system of Ponticoccus sp. PD-2, a microalgae eutrophic bacterium, was studied. The relationship between its anti-algal activity and colony induction was investigated by using CRISPRR / CAS9 technique to successfully knockout the genes ZlaI and zlbI. The main research contents are as follows: in this paper, we analyzed the genome sequence of PD-2 and found two pairs of colony sensing genes (luxIr / R homologous genes) named zla I / R and zlbi / r / r. By constructing phylogenetic tree and analyzing the sequence alignment of multiplex proteins, it was found that the homology of these two pairs of proteins was higher than 69, and the amino acid sequences of luxI homologous proteins were highly conserved. The number and type of AHLs produced by PD-2 were detected by biosensor and GC-MS. It was found that the bacteria could produce at least two kinds of AHLs, namely OC8-HSL and OC10-HSL. The zla I and zlbI genes were cloned and ligated into the expression plant pGEX-6P-1, which was highly expressed in E. scherichia coli BL21. The biosynthesis of OC8-HSL and OC10-HSL showed that both luxI homologous genes could synthesize OC8-HSL and OC10-HSL, and OC8-HSL was mainly regulated by zlbI. In this paper, we found that the metabolites of PD-2 had obvious inhibitory effects on the growth of three species of red tide algae (Prorocentrum, Phaeocystis and Alexandrium tamaranopyrium), and had the strongest inhibitory effect on the host Prorocentrum of the East China Sea. After adding AHLs signal molecule inhibitor 尾 -cyclodextrin to PD-2 medium, we found that the content of PD-2 signal molecule decreased significantly. The algal activity of PD-2 was also decreased by 50% -80% after the decrease of AHLs signaling molecule, which indicated that quenching QS system could affect the production of algal inhibitor in PD-2. In this paper, the CRISPRR / Cas9 gene editing system was used to successfully knock out the two AHLs synthase genes ZlaI and zlbIfrom PD-2, and to realize the application of CRISPRP / CAS9 in marine bacteria. The AHLs and anti-algal activity of PD-2zla I and zlbI deletion mutants were detected. The results showed that PD-2 of the knockout luxI homologous gene no longer produced AHLs signaling molecules, and its anti-algal function disappeared. The results further demonstrated that the inhibitory activity of PD-2 was regulated by population sensing system at molecular level.
【学位授予单位】：国家海洋局第一海洋研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78;X55

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 张孝杰;陈学豪;周立红;;两种固定化方法的抑藻剂效果研究[J];集美大学学报(自然科学版);2013年02期

2 倪利晓;陈世金;任高翔;郝向阳;;陆生植物化感作用的抑藻研究进展[J];生态环境学报;2011年Z1期

3 郑小伟;黄丽萍;张帮周;张金龙;杨小茹;郑天凌;;一株高效抑藻放线菌的分离筛选及鉴定[J];厦门大学学报(自然科学版);2012年05期

4 张振业;吴晓霞;张俊松;杨文彬;金银根;;植物化感抑藻作用的研究进展[J];广东农业科学;2012年19期

5 何宗祥;张庭廷;;四种十八碳脂肪酸抑藻时-效关系分析的数学模型设计[J];生态学报;2011年23期

6 杨善元,俞子文,孙文浩,赵秉文,余叔文,吴厚铭,黄胜余,周惠强,马侃,劳霞飞;凤眼莲根系中抑藻物质分离与鉴定[J];植物生理学报;1992年04期

7 刘智军;任虹;蔡明凯;吉方英;;超声波抑藻效果及影响因素研究[J];土木建筑与环境工程;2011年S1期

8 瞿建宏;;植物化感抑藻物质的研究进展[J];现代农业科技;2008年09期

9 洪喻;胡洪营;;水生植物化感抑藻作用研究与应用[J];科学通报;2009年03期

10 孙颖颖;董晓柯;李光成;阎斌伦;王长海;;浒苔抑藻物质的分离及其对赤潮微藻的抑制作用[J];水产学报;2014年06期

相关会议论文 前6条

1 胡光济;张维昊;聂莹晖;;高等水生植物化感抑藻的研究进展[A];中国环境科学学会2009年学术年会论文集（第一卷）[C];2009年

2 张维昊;丁惠君;吴小刚;周连凤;;几种湿生植物抑藻化感作用研究[A];科技创新与绿色植保——中国植物保护学会2006学术年会论文集[C];2006年

3 徐年军;;大米草对赤潮藻的抑制作用及其抑藻物质的分离鉴定[A];中国第四届植物化感作用学术研讨会论文摘要集[C];2009年

4 种云霄;汤仲恩;吴启堂;;铜离子对沉水植物种植水抑藻的强化效应研究[A];中国第四届植物化感作用学术研讨会论文摘要集[C];2009年

5 黄伟;郭沛涌;陈淑芳;;蜘蛛兰净化不同程度富营养水体中氮磷及抑藻效应研究[A];2013中国环境科学学会学术年会论文集（第五卷）[C];2013年

6 鲜U_鸣;陈海东;邹惠仙;尹大强;;金鱼藻(Ceratophyllum demersum L.)种植水中抑藻物质的初步分析[A];中国第二届植物化感作用学术研讨会暨中国植物保护学会植物化感作用专业委员会成立大会论文摘要集[C];2005年

相关重要报纸文章 前2条

1 泗阳县裴圩镇政府 周道山 张福君;裴圩镇抑藻净水养殖获得成功[N];江苏农业科技报;2009年

2 记者 李高产　实习生 胡楠;求解大水域抑藻治污世界性难题[N];湖北日报;2009年

相关博士学位论文 前1条

1 周立红;基于化感作用的环境友好型抑藻剂的研究[D];厦门大学;2008年

相关硕士学位论文 前10条

1 迟雯丹;海洋细菌Ponticoccus sp. PD-2群体感应系统及对抑藻功能的调控探究[D];国家海洋局第一海洋研究所;2017年

2 张孝杰;白千层的抑藻机理及其应用研究[D];集美大学;2013年

3 张卫明;抑藻剂对水体中藻类去除效果的研究[D];河北工程大学;2012年

4 李藩;小麦麸皮水浸提液中抑藻物质分离与鉴定[D];湖南农业大学;2013年

5 滕丽君;培养条件对串珠镰刀菌提取物抑藻活性的影响[D];安徽农业大学;2011年

6 冯阳;滇池细菌优势种抑藻物质的分离纯化及其抑藻机理[D];云南大学;2012年

7 侯明;高等水生景观植物化感抑藻作用研究[D];华北电力大学;2012年

8 刘智军;超声波除藻抑藻及藻渣最终处理系统研究[D];重庆大学;2011年

9 李馨子;海洋细菌PD-2抑藻活性研究及群体感应基因zlb I敲除方法的建立[D];国家海洋局第一海洋研究所;2014年

10 章典;复合化感物质抑藻效应及其对微囊藻毒素生物合成影响的研究[D];安徽师范大学;2012年

，

本文编号：2127604