组胺在网纹藤壶幼虫附着变态过程中的作用

发布时间：2018-12-17 03:46

【摘要】：随着人们对海洋资源的开发利用,海洋生物污损所造成的损失越来越严重,研究开发对环境无毒无害、高效的传统毒性涂料替代品成为人们关注的话题。海洋中的污损生物种类繁多,其中藤壶是海洋污损生物中最具代表性的一种,对环境有较强的适应性,是海洋污损生物的重要物种。目前寻找无毒抗污损活性化学品的研究已广泛开展,基于的原理有抑制附着、抑制变态、干扰神经或传导等。本文针对网纹藤壶幼虫的附着变态问题,首先通过实验室模拟的方法,建立实验室幼虫附着变态测试模型。包括寻找出幼虫的最适生长环境,对幼虫的附着变态进行初步的研究。其次,利用前期研究发现的从海洋放线菌Streptomyces fungicidicus的代谢产物中分离鉴定出两个flavone类化合物,测定了其抗藤壶幼虫附着的活性,并验证该活性测试模型。结果表明,genistein具有较好的抗幼虫附着活性。同时,验证实验还发现mizolastine的功能类似物(H1受体拮抗剂)对幼虫的附着变态有一定的影响。所以,本文主要从mizolastine的功能类似物着手,进行抗幼虫附着变态的实验研究,筛选出最优的抗污损活性化合物,阐明组胺在藤壶幼虫附着变态中的作用。本文的主要研究结果如下：(1)实验室研究发现,网纹藤壶适合生长在水温约22℃以上的环境中,温度过低时,不利于网纹藤壶的繁殖和生长。网纹藤壶产卵受精后,受精卵发育到无节幼虫后才能完成孵化,无节幼虫的个体较小,对环境的适应能力相对较差。实验室中,通过不同环境的比较,选出适于无节幼虫(nauplii)的生长环境,使无节幼虫(nauplii)变态为金星幼虫(cyprid)在约6d内完成,该过程在恒温环境(28℃±1℃)中进行,用角毛藻喂养。(2)根据前期实验发现的mizolastine可以阻止藤壶生物幼虫的附着变态,根据其作为组胺信号分子受体拮抗剂的功能,筛选出35种信号分子受体干扰物质,并对此35种信号干扰物质进行幼虫的附着变态实验。实验结果发现了8种优良的无毒的抗污损活性化合物,在2.5μg ml-1浓度下可完全抑制幼虫的附着变态。它们分别是：Loratadine、Ondansetron hydrochloride、Antazoline hydrochloride、Clemastine fumarate、Triprolidine hydrochlorise、 Azelastine hydrochloride、Propranolol hydrochloride和Clorprenaline hydrochloride。这些优良的无毒抗污损活性化合物的抗污损效果接近或超过现实应用的传统毒性抗污损化合物,而毒性低于传统毒性抗污损化合物10-100倍。除了此8种优选物质外,还有4种活性较强的(Risperidone、Ketotifen fumarate、Tegaserod maleate和Clenbuterol hydrochloride)和6种有一定活性的抗污损活性化合物(Amitriptyline hydrochloride、Promethazine hydrochloride、Phenylephrine hydrochloride、Phentolamine Mesylate、Diphenhydramine hydrochloride和Lafutidine),它们分别可以在5μg ml-1及5-10μgml-1浓度下完全抑制幼虫附着。从实验中发现,8种最优抗污损活性化合物中有5种为组胺H1受体拮抗剂(Loratadine、Antazoline hydrochloride、Clemastine fumarate、 Triprolidine hydrochlorise和Azelastine hydrochloride),故推测活性产生的原因可能和干扰histamine信号途径有关系。(3)8种最优的抗污损活性化合物的深入研究。针对8种最优的抗污损活性物质,进行了不同浓度处理条件下的幼虫附着变态情况的研究。根据不同浓度下的幼虫附着变态受抑制程度和处理浓度的关系,计算出每个样品的EC50值。实验结果发现,此8种活性物质的EC50分别为：Loratadine:EC500.625 μgml-1; Ondansetron hydrochloride:EC50=1.52μg ml-1; Antazoline hydrochloride:EC500.625μg ml-1; Clemastine fumarate:EC500.2μg m-1; Triprolidine hydrochlorise:EC50=O.91μg ml-1; Azelastine hydrochloride:EC50O.2 μgml-1; Propranolol hydrochloride:EC50=0.73μg ml-1; Clorprenaline hydrochloride:EC50=0.72μg ml-1。实验中发现这些样品在20μg ml-1的浓度下对幼虫的致死率几乎没明显贡献,说明这些化合物为高效低毒的具有应用潜力的抗污损活性化合物。(4)验证histamine参与幼虫的附着变态的信号传导。由于前述实验发现多个组胺受体的拮抗剂高效抑制幼虫的附着变态,所以,本文还对组胺是否参与幼虫的附着变态进行了验证。验证内容主要分成三个部分：第一,正常状态的幼虫体内是否含有组胺,这也是组胺参与幼虫生理活动的物质基础；第二,外源添加组胺是否可以促进幼虫的附着变态过程；第三,原本受信号干扰物质关闭组胺信号通路的幼虫,在新鲜环境中或增加histamine信号强度,可否完成附着变态过程。通过HPLC-Fr分析发现,在nauplii幼虫和cyprid幼虫体内均含有histamine，，因此这两种不同发育阶段的幼虫均有了使用histamine作为信号传递载体的物质基础。在nauplii幼虫变态为cyprid幼虫的过程中,外源添加10-8、10-10、 10-12mol/L的histamine均可以有效减短培育时间,并提高变态率。其中,10-10mol/L的浓度处理效果最为显著。而且本文培养了一种低能量的cyprid幼虫,由于自身存储的能量较少,原本能完成正常的附着变态的能力较弱。通过外源加入histamine,发现加入的组胺可促进幼虫的附着变态。添加的histamine的最适浓度为5×10-9mol/L,高于或低于这一浓度时,对幼虫附着变态的促进作用明显减弱。最后,本文还设计了一种恢复实验,即先用组胺受体拮抗剂抑制组胺信号,发现幼虫不能完成附着变态过程；然后将处理的幼虫清洗后,分成两组放入含有5 ×10-9 mol/L histamine或新鲜海水中,比较在新环境中的幼虫完成附着变态的情况。实验结果发现,histamine可有效解除原本histamine信号关闭的幼虫不能附着变态的情况。所以,本文三方面的证据验证了histamine参与幼虫的附着变态的信号传递。本论文的研究结果表明,抗组胺物质是良好的抗海洋生物污损化学物的候选品,并证明了组胺存在于藤壶幼虫的体内,并参与其附着变态过程的信号传递。
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【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X55

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