氮、磷营养物质与微生物对微小亚历山大藻（Alexandrium Minutum）生长和毒素产生的影响

发布时间：2020-05-16 22:40

【摘要】：近年来，对于有毒赤潮及其危害效应的研究越来越受到关注。有毒赤潮的危害不仅取决于赤潮的生物量，还受到藻细胞毒素含量的影响。对于能够形成有毒赤潮的甲藻，其生长和毒素产生受诸多因素影响，其中营养物质和微生物是非常重要的影响因子。本文以微小亚历山大藻作为模式生物，系统探讨了不同类型的氮、磷营养物质对微小亚历山大藻（Alexandrium minutum）生长和毒素产生的影响；同时，通过组合抗生素处理，初步探讨了甲藻培养系中细菌的去除对其生长和毒素产生的影响。研究表明：在氮饥饿条件下，硝酸钠和酵母浸出粉能促进微小亚历山大藻的生长和产毒；高浓度的氯化铵对微小亚历山大藻有短时的毒性效应；这三者培养的微小亚历山大藻生长和产毒量相似，生长速率分别为 0.16、0.21 和 0.21/d，最高细胞毒素含量分别为 12.86、14.64 和 11.85fmol/cell。但尿素对微小亚历山大藻的生长和产毒的促进作用都很弱，细胞密度维持在 10,000cells/ml，细胞毒素含量维持在 6.0－8.0fmol/cell 之间。四种含氮营养盐对微小亚历山大藻毒素组成的影响都很小。在磷限制条件下，加入磷酸二氢钾、磷酸甘油和 ATP 均能促进生长和产毒，最大藻细胞密度分别为 22,700、28,400 和 27,800cells/ml，对数期生长速率分别是 0.12、0.14 和 0.15/d，稳定期藻细胞毒素含量分别为 22.87、23.98 和 21.80fmol/cell。磷限制不仅使微小亚历山大藻细胞毒素含量增加，而且显著改变毒素组成，表现为 GTX1/4 含量增加，GTX2/3 含量减少。磷限制使藻的碱性磷酸酶活性升高，添加有机磷营养盐的藻碱性磷酸酶活性显著高于添加无机磷营养盐的藻。通过实验建立了组合抗生素处理消除培养液中细菌的方法。通过 2216E 培养基培养和细菌 DNA 的 PCR 扩增两种检测方法发现，环丙沙星、庆大霉素、链霉素和青霉素抗生素组合及环丙沙星、庆大霉素链霉素、青霉素、卡那霉素和新霉素抗生素组合都能有效除去藻培养液中的细菌。但除去细菌的同时，真菌等大量 I WP=5 张清春氮、磷营养物质与微生物对微小亚历山大藻生长和毒素产生的影响硕士学位论文的繁殖，微小亚历山大藻对两性霉素 B 的抗真菌药物很敏感，无法直接使用抗真菌药物处理。研究探讨了5－甲氧基色胺对微小亚历山大藻孢囊诱导的条件及其在无菌藻制备中的可应用性。结果发现在添加 5－甲氧基色胺后 8 小时内，暂时性孢囊的形成率最高；对数期微小亚历山大藻比稳定期的对 5－甲氧基色胺敏感；24 小时后，稳定期的微小亚历山大藻的成孢囊率在 4.0×10-5M 组最高，达到 30.84％；而对数期的藻成孢囊率在 2.0×10-5M 组最高，成孢囊率为 12.27％。高浓度组由于孢囊的破裂使得成孢囊率急剧下降。通过实验比较了诱导产生的孢囊对不同抗生素处理的耐受状况。除了用两性霉素 B、两性霉素 B 和 5－氟胞嘧啶处理 3 天的孢囊不能形成营养细胞外，其它组均有孢囊形成营养细胞。尽管目前尚未应用孢囊诱导技术建立起真正意义上的无菌藻，但这一技术显示了较好的应用潜力，值得继续尝试。通过比较组合抗生素处理前后微小亚历山大藻的生长和产毒状况，发现带菌藻培养液中细菌数量与藻的生长呈负相关。组合抗生素处理后，微小亚历山大藻的生长速率、最大细胞密度比带菌藻明显降低，稳定期的维持时间也变短。在毒素产生方面，抗生素处理藻的毒素含量有所降低，但毒素组成并没有明显变化。总之，本文通过探讨营养物质和细菌等对微小亚历山大藻生长和毒素产生的影响，阐明了微小亚历山大藻对不同类型营养物质利用状况的差异，以及藻细胞毒性相应的变化情况；初步探讨了细菌对甲藻生长和毒素产生的影响，建立了组合抗生素处理制备无菌藻的方法，并首次尝试将甲藻孢囊诱导应用于无菌藻的制备，这为探讨有毒甲藻赤潮的发生机制及毒素产生机理提供了相应的科学依据。
【图文】：

色谱图,柱后衍生,毒素,色谱图

C图 4. PSP 毒素的 PHLC 柱后衍生分析的色谱图A: GTX1/4 标准毒素 B: GTX2/3 标准毒素 C: A. minutum 藻毒素Fig.4 The chromatograms of HPLC methods developed for PSP toxinsanalysis with post column deriveitizationA: GTX1/4 standard toxin B: GTX2/3 standard toxin C: toxin of A. minutum微小亚历山大藻能够产生四种麻痹性贝毒毒素，分别为 GTX1，GTX2，GTX3和 GTX4。其中 GTX1 和 GTX4 在 1 位 N 上的取代基为羟基，属 N-OH 类毒素，而 GTX2 和 GTX3 在 1 位 N 上的取代基为氢，，属于 N-H 类毒素。而 GTX1 和GTX4，GTX2 和 GTX3 又分别是空间异构体，根据空间构型的差别可以将 GTX1和 GTX2 归为α异构体，GTX3 和 GTX4 归为β异构体。从图 4 可以看出，GTX1/4标准毒素的中 GTX4 的色谱峰的保留时间为 6.55 分钟，GTX1 为 8.02 分钟；

电泳图,亚历山大藻,细菌DNA,琼脂糖凝胶电泳

16. 微小亚历山大藻的藻液中细菌 DNAPCR 产物琼脂糖凝胶（其中 B：空白；C：对照 1 组；M：Marker）16 Agarose gel electrophoresis of the PCR amplification products DNA obtained form A. minutum culture medium(B: Blank C: control M: Marker)取的各组细菌 DNA 进行 PCR 扩增后的电泳图如图 16，空白100bp 的条带，这是引物带。Marker 为 DNAMarker DL2000（TaK 100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp DNA 片段，每条带的 DNA 量约为 50ng。对照组的两个平行均在大约 20的条带，这就是引物 1 和 2 PCR 扩增出来的大约 200bp 左右基因片段；而 A1 组、B1 组、A2 组、B2 组、A3 组和 B3 组均B C C A1 A1 B1 B1 A2 B2 A3 A3 B3 B3 M
【学位授予单位】：中国科学院研究生院（海洋研究所）
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：X55

【参考文献】