新型抗菌肽的设计、生物活性及与磷脂膜的相互作用

发布时间：2017-04-10 14:25

  本文关键词：新型抗菌肽的设计、生物活性及与磷脂膜的相互作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：抗菌肽是组成免疫系统的重要内源性抗菌分子。它们大多含10-50个氨基酸,其中大约有50%为疏水性氨基酸,并且富含正电荷氨基酸。抗菌肽具有两大突出优点:第一,抗菌肽大多具有广谱抗菌性;第二,抗菌肽的主要作用靶点是微生物的细胞膜,微生物很难对此产生抗药性。所以,抗菌肽有望成为新一代的抗菌药物。然而,在临床应用之前抗菌肽的作用机理、生物利用率、副作用等基本问题需要解决。因此,基础性研究以及临床应用都需要高质量的多肽来满足需求。从头设计是一种快速、高效的获得抗菌肽的方式之一。本论文基于已有抗菌肽的组成和结构特点设计、合成了新型的抗菌肽,对所设计的多肽进行了生物活性的检验,并利用模拟生物膜对所设计多肽与生物膜之间的相互作用进行了研究,从分子水平上为抗菌肽的活性提供了初步的依据。本文首先利用微量热泳动法研究了具有较好抑菌活性、低细胞毒性和溶血性的抗菌肽l-RW与模拟生物膜-脂质体间的相互作用,在分子水平上为抗菌肽的设计提供依据,并据此提出了新型的脂肽类抗菌肽的设计。实验比较了抗菌肽l-RW对细菌生物膜的主要成分磷脂酰甘油(DMPG)以及细胞生物膜主要成分磷脂酰胆碱(DMPC)的亲和力的大小。结果表明l-RW对带负电荷的DMPG脂质体亲和力较大,选择性更强,静电作用对多肽与脂质体间的相互作用产生巨大的影响。与PBS缓冲溶液相比,在MH细菌培养基中多肽l-RW与脂质体DMPG相互作用更强,在细胞培养液RH1640、0.9%Na Cl中多肽l-RW与脂质体DMPC的相互作用更弱。该实验结果和l-RW的生物活性实验结果基本一致。此外,我们还比较了l-RW对各种细菌细胞膜提取物的亲和力大小,结果显示l-RW对金色葡萄球菌细胞膜脂质成分的选择性要强于对大肠杆菌、铜绿单假胞杆菌,该结果与l-RW对金色葡萄球菌具有更强的抑菌效果结果一致。此外,我们还考察了在不同浓度的胎牛血清中l-RW与不同脂质体亲和力的大小,实验结果表明随着血清浓度的增大,l-RW与DMPG/DMPC的亲和力均减弱。进一步的研究表明血清中的血清白蛋白成分减弱了l-RW与磷脂的亲和力。实验结果说明在生物液体中l-RW的利用度会减弱,在临床应用时可用于外用。由于利用微量热泳动法所获得的抗菌肽l-RW和脂质成分的亲和力与l-RW的生物活性基本一致,因此亲和力的大小可以在一定程度上预测抗菌肽的生物活性。抗菌肽l-RW具有较好抑菌活性、低细胞毒性和溶血性,和其组成和结构具有重要的关系。l-RW富含精氨酸和色氨酸且结构上形成亲水疏水的两亲性。然而由于多种酶的降解作用,由天然氨基酸所组成的多肽在体内稳定性不高,不利于其在体内发挥作用。因此在抗菌肽设计中引入非天然氨基酸基团可以降低酶的降解,有效提高抗菌肽在体内的稳定性,提高其利用效率。脂肪酸是一种生物膜中磷脂的组成部分,具有较高的疏水性。将该基团引入抗菌肽设计,替代抗菌肽中的疏水氨基酸,将有可能在保持抗菌肽活性的同时,减少酶对其的降解,提高多肽的稳定性。结合l-RW的特点,我们采用脂肪酸作为疏水基团,带正电的精氨酸作为亲水头基设计新型的脂肽类抗菌肽。通过研究其抑菌活性、溶血性等生物活性,探究脂肪酸链长短和数目、氨基酸头基电荷、色氨酸位置等因素对脂肽活性的影响。C12-R4具有一定的抑菌性且溶血性较低,其他单脂肽虽具有抑菌活性但其溶血性较强。色氨酸影响脂肽的生物活性,它的引入使得脂肽的双亲性结构变得混乱,从而使其活性性下降。双脂肪酸链的疏水性过强,影响了其生物活性。此外,本文通过探究脂肽与模拟生物膜的相互作用,初步讨论了新型脂肽对生物膜的作用机理。我们通过探究脂肽与DMPG、DMPC脂质体作用后脂质体粒径的改变来研究脂肽对生物膜的破坏作用。结果表明单链脂肽均能瓦解磷脂膜,双链肽均不能有效的瓦解磷脂膜与其生物活性相一致。因此脂肽对膜的破坏作用是脂肽生物活性的重要来源。色氨酸荧光猝灭实验结果表明脂肽的亲水头基能够有效地进入到脂质体内部,从而发挥破坏作用。对脂肽-磷脂单分子层的混合体系进行了热力学稳定性分析,结果表明脂肽与磷脂易于混合。通过本论文我们可以得出:利用微量热泳动技术可以获得抗菌肽和脂质成分的亲和力大小,在一定程度上预测抗菌肽的生物活性;由精氨酸和脂肪酸链所组成的脂肽表现出较高的抑菌活性,但较大的疏水基团也使得脂肽表现出较高的溶血性,限制了其应用,因此静电作用、疏水性等参数共同控制抗菌肽的生物活性,必须使这些参数达到平衡,抗菌肽才可能表现出理想的生物活性。该研究为今后抗菌肽的设计以及筛选提供了新的方法及思路。
【关键词】：抗菌肽 生物活性 磷脂膜 脂肽
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ465
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-11
• 第一章 绪论11-20
• 1.1 抗菌肽的来源11-13
• 1.1.1 植物源11-12
• 1.1.2 动物源12
• 1.1.3 微生物合成12-13
• 1.1.4 人工合成13
• 1.2 抗菌肽的结构以及生物活性13-14
• 1.3 脂肽14-16
• 1.3.1 脂肽的结构15
• 1.3.2 脂肽的分离纯化和鉴定15-16
• 1.4 抗菌肽数据库的发展16
• 1.5 抗菌肽的应用16-17
• 1.5.1 抗菌肽在植物领域的应用16
• 1.5.2 抗菌肽在食品中的应用16-17
• 1.5.3 抗菌肽在药用领域的研究与应用17
• 1.5.4 抗菌肽在水产养殖领域的研究与应用17
• 1.6 抗菌肽应用中存在的问题17-18
• 1.7 论文的研究目的及意义18
• 1.8 论文的研究内容18-20
• 第二章 新型抗菌肽的设计20-34
• 2.1 材料和方法21-23
• 2.1.1 实验仪器与试剂21
• 2.1.2 实验方法以及原理21-23
• 2.2 微量热泳动实验结果与讨论23-30
• 2.3 抗菌肽的设计30-34
• 第三章 新型脂肽的生物活性34-42
• 3.1 材料与方法34-36
• 3.1.1 实验菌株34
• 3.1.2 主要试剂与耗材34-35
• 3.1.3 仪器设备35
• 3.1.4 脂肽的抑菌性实验35
• 3.1.5 脂肽的溶血实验35-36
• 3.2 脂肽的抑菌性实验36-37
• 3.3 脂肽的溶血性37-41
• 3.4 小结41-42
• 第四章 新型抗菌肽与磷脂膜的相互作用42-66
• 4.1 材料与方法42-43
• 4.1.1 实验仪器与试剂42
• 4.1.2 脂质体实验42
• 4.1.3 荧光淬灭法研究脂肽与脂质体膜的相互作用42-43
• 4.1.4 LB膜法研究抗菌肽与磷脂间的相互作用43
• 4.2 结果与讨论43-65
• 4.2.1 脂质体实验43-47
• 4.2.2 荧光猝灭法研究脂肽与脂质体的相互作用47-53
• 4.2.3 LB膜法研究研究脂肽与磷脂膜的相互作用53-65
• 4.3 小结65-66
• 第五章 结论66-67
• 参考文献67-72
• 致谢72-73
• 附录 硕士研究生期间发表论文73

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本文编号：296914