功能化石墨烯的制备及其细胞毒性和基因转染研究

发布时间：2017-08-24 01:17

  本文关键词：功能化石墨烯的制备及其细胞毒性和基因转染研究

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【摘要】：石墨烯大的比表面积以及芳香共轭结构等特点,为基因或其他化学药物的负载提供了条件。但是,未经处理的石墨烯具有在水溶液中分散性差和易发生团聚等缺点,导致其应用受到了限制,尤其在生命科学领域。通过合适的方法对石墨烯进行修饰,增大其分散性以及生物相容性,充分拓展石墨烯在生命科学领域的应用是目前研究的重点。本文采用混酸(浓H2SO4和浓HNO3,V/V=3:1)氧化处理石墨烯得到氧化石墨烯;并分析了氧纳米材料化石墨烯-壳聚糖-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽纳米粒子杂化物(GO-CHIT-RGD NPs)对黑色素瘤细胞(A375)产生较大毒性的原因。且结合精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽(Arg-Gly-Asp三肽,RGD)、间氨基苯硼酸(3-Aminophenylboronic acid,ABA)、4-氨基苯-β-D-半乳糖苷(4-aminophenylβ-D-Galactopyranoside,GAL)、聚酰胺-胺(PAMAM)和葡萄糖酸(Gluconic acid,GA)的特点,利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)偶联的方法合成了氧化石墨烯-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽杂化物(GO-RGD)、氧化石墨烯-间氨基苯硼酸(GO-ABA)、氧化石墨烯-半乳糖(GO-GAL)和氧化石墨烯-聚酰胺-胺-葡萄糖酸(GO-PAMAM-GA)复合物。评价了GO-RGD、GO-ABA和GO-GAL复合材料对不同细胞的体外细胞毒性,并初步分析了其对不同细胞系产生选择性细胞毒性的原因。评价了GO-PAMAM-GA复合材料作为基因载体对不同细胞系的细胞毒性,以及其对不同细胞系的基因转染性能。具体工作如下:1.利用混酸氧化处理石墨烯得到氧化石墨烯,采用ftir、tem、xps和zeta电位对其表面官能团和表面电位及其粒径进行了表征;用噻唑蓝(mtt)法和细胞毒性检测试剂盒(cck-8)评价了所制备的材料对不同细胞系的活力影响;用酶联免疫吸附试剂盒(elisa)测定a375、hela和mcf-7细胞表面整合素αvβ3(itgαvβ3)的含量和用活性氧检测试剂盒检测不同浓度的go-chit-rgdnps诱导a375细胞、宫颈癌细胞(hela)和乳腺癌细胞(mcf-7)产生的活性氧(ros)。结果表明,混酸处理后的氧化石墨烯比未处理石墨烯具有更好的生物相容性和在溶液中的稳定性。go-chit-rgdnps对a375细胞的特异性毒性是go、chit和rgd三者共同作用的结果;且其对正常细胞(人脐静脉内皮细胞、huvec)活力影响较小,结果表明可能是由于a375表面的整合素含量较高,go-chit-rgdnps能与其特异性结合,从而使a375细胞内的活性氧含量升高,导致细胞凋亡。2.利用edc和nhs作偶联剂的方法在温和的条件下合成了go-rgd、go-aba和go-gal,并采用ftir和zeta电位对其是否成功偶联和表面电位及粒径进行表征。用wst-8法评价了go-rgd和go-aba对a375、hela和mcf-7细胞的毒性和go-gal对a375、hela和肝癌细胞(hepg-2)的毒性。结果表明,go-rgd对a375具有特异性毒性,可能是由于a375表面的整合素过表达,且GO-RGD能与其特异性结合使细胞内产生的活性氧含量增多,致使细胞凋亡。3.利用EDC和NHS作偶联剂的方法在温和的条件下合成了GO-PAMAM-GA,并采用FTIR、TEM和Zeta电位对其是否成功偶联、微观形貌和表面电位和粒径进行表征。用WST-8法评价了GO-PAMAM-GA对A375、HeLa和MCF-7细胞的毒性,GO和GO-PAMAM对人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)的毒性。利用GO-PAMAM-GA复合物作为基因载体介导pEGFP质粒转染A375和MCF-7细胞的性能研究。结果表明,GO-PAMAM-GA对细胞的生物相容性差,虽可以将pEGFP-N1转运至细胞内,并成功表达,但转染效率不高,GO和GO-PAMAM对SK-N-SH细胞的生物相容性均较好。
【关键词】：石墨烯 功能化修饰 体外细胞毒性 基因转染性能
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q-33;TQ127.11
【目录】：

• 中文摘要3-6
• ABSTRACT6-12
• 第一章 绪论12-22
• 1.1 肿瘤的靶向治疗12-13
• 1.2 石墨烯简介13-15
• 1.2.1 石墨烯的结构与性质13
• 1.2.2 石墨烯的功能化13-14
• 1.2.3 石墨烯在生物医学领域的应用14-15
• 1.3 整合素15-17
• 1.3.1 整合素 α_v?_3的结构与功能特点15-16
• 1.3.2 RGD肽的结构及其功能16-17
• 1.4 唾液酸17-18
• 1.4.1 唾液酸结构与存在17
• 1.4.2 唾液酸在恶性肿瘤中的表达17
• 1.4.3 唾液酸在恶性肿瘤细胞中的生物行为17-18
• 1.4.4 唾液酸与恶性肿瘤防治的展望18
• 1.5 聚酰胺-胺（PAMAM）18-20
• 1.5.1 PAMAM树形分子的性质18-20
• 1.5.2 PAMAM树状大分子在基因载体方面的运用20
• 1.6 本文构思20-22
• 第二章 氧化石墨烯-衍生壳聚糖杂化物的细胞毒性研究22-46
• 2.1 引言22-23
• 2.2 实验部分23-27
• 2.2.1 试剂与仪器23-24
• 2.2.2 细胞培养24-25
• 2.2.3 石墨烯复合物的合成25
• 2.2.4 整合素 α_vβ_3含量的测定25-26
• 2.2.5 MTT和WST-8 实验26-27
• 2.2.6 活性氧测定27
• 2.3 结果与讨论27-44
• 2.3.1 GO的红外和电子衍射分析27-28
• 2.3.2 经混酸处理后得到的GO羧基含量表征28
• 2.3.3 两种GO在不同溶剂中表面电位、粒径分析表征比较28-29
• 2.3.4 两种GO的分散性表征29-30
• 2.3.5 GO及未处理石墨烯对细胞毒性研究30-35
• 2.3.6 复合物纳米粒子对细胞的毒性研究35-43
• 2.3.7 整合素α_Vβ_3含量的测定结果43
• 2.3.8 活性氧测定结果43-44
• 2.4 小结44-46
• 第三章 氧化石墨烯-配基复合物的合成及其细胞毒性研究46-62
• 3.1 引言46
• 3.2 实验部分46-48
• 3.2.1 试剂与仪器46-47
• 3.2.2 样品的制备47
• 3.2.3 WST-8 法检测样品对细胞的毒性47
• 3.2.4 活性氧测定47-48
• 3.3 结果与讨论48-60
• 3.3.1 GO-RGD、GO-ABA和GO-GAL的FTIR分析48-49
• 3.3.2 样品在溶剂中表面电位和粒径分析表征49-51
• 3.3.3 样品分散性表征51-52
• 3.3.4 WST-8 法检测样品对细胞的毒性52-59
• 3.3.5 活性氧测定结果59-60
• 3.4 小结60-62
• 第四章 氧化石墨烯-聚酰胺-胺-葡萄糖酸体外细胞毒性和pEGFP-N1转染性能研究62-74
• 4.1 引言62
• 4.2 实验部分62-64
• 4.2.1 试剂和仪器62-63
• 4.2.2 GO-PAMAM-GA复合物样品的制备63
• 4.2.3 WST-8 法检测复合物对细胞的毒性63-64
• 4.2.4 GO-PAMAM-GA复合物介导pEGFP基因对细胞转染实验64
• 4.3 结果与讨论64-73
• 4.3.1 GO-PAMAM-GA的FTIR分析64-65
• 4.3.2 GO-PAMAM-GA在溶剂中表面电荷和粒径分析表征65-66
• 4.3.3 GO-PAMAM-GA分散性能表征66
• 4.3.4 材料对细胞毒性研究66-71
• 4.3.6 GO-PAMAM-GA介导pEGFP-N1基因对细胞转染性能研究71-73
• 4.4 本章小结73-74
• 总结74-76
• 参考文献76-83
• 附录83-84
• 致谢84-85

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本文编号：728378