氧化葡萄糖酸杆菌全细胞催化木糖酸关键性抑制物的分子响应机制

发布时间：2017-10-11 18:31

  本文关键词：氧化葡萄糖酸杆菌全细胞催化木糖酸关键性抑制物的分子响应机制

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【摘要】：本论文针对氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans NL71)全细胞原位催化木质纤维原料稀酸水解液合成木糖酸的抑制问题,测试并筛选出三种典型抑制物甲酸、糠醛和对羟基苯甲醛,研究了它们对木糖酸全细胞催化抑制的反应动力学。基于高通量测序技术测定G.oxydans NL71的全基因组,以此为对照建立三种抑制物物条件下的全细胞催化木糖合成木糖酸的特征转录谱,通过RQ-PCR分析解析抑制物响应的关键基因并探索其分子调控机制。研究结果表明,甲酸、糠醛和对羟基苯甲醛是氧化葡萄糖酸杆菌全细胞原位催化木质纤维原料稀酸水解液合成木糖酸的主要抑制物。5 g/L甲酸、8 g/L糠醛、3 g/L对羟基苯甲醛单独存在时即对细胞催化性能产生明显的抑制毒性,导致木糖利用速率和木糖酸产率显著下降。基于木质纤维原料木糖氧化葡萄糖酸杆菌全细胞催化制取木糖酸的生产水平分析,甲酸抑制作用最为明显,其次为糠醛和对羟基苯甲醛。基于Hiseq 2500和Miseq测序平台完成G.oxydans NL71基因组测序工作并提交至NCBI(编号LCTG00000000)。G.oxydans NL71基因组大小为3.25 Mb,GC含量55.71%,含有编码基因3226个,非编码基因(59个tRNA,5组rRNA),基因岛11个,前噬菌体3个。G.oxydans NL71基因组基因功能注释分析,GO、KEGG、COG、NR、Swiss-Prot、TrEMBL注释得到的结果分别为1124、1758、1600、3012、1161和2964。采用Hiseq 2000高通量测序平台测定在甲酸、糠醛和对羟基苯甲醛条件下氧化葡萄糖杆菌全细胞催化木糖合成木糖酸的的转录组。通过与空白对照比较研究,在分子转录水平上分别获得甲酸、糠醛、对羟基苯甲酸响应的目标基因572、714和408个。结合实时转录PCR验证进一步筛选得到19个主要的抑制物响应基因,主要包括:糖酵解途径的甘油醛3-磷酸脱氢酶(NL71GM001713),三羧酸循环的2-酮戊二酸脱氢酶(NL71GM001355),磷酸戊糖途径的核糖5-磷酸异构酶(NL71GM001290),细胞转运系统和分泌系统的蛋白(NL71GM001291、NL71GM001292、NL71GM000616、NL71GM002123),细菌化学趋向性蛋白(NL71GM000741、NL71GM000736),电子传递的硫氧化还原蛋白(NL71GM000876)、NAD(P)转氢酶组成亚基(NL71GM002001)、乙醇脱氢酶(NL71GM001165)、铁氧化还原酶(NL71GM000337)、单硫基谷氧还蛋白(NL71GM002512),细胞脱毒作用的过氧化物氧化还原酶(NL71GM001610)、烷基过氧化氢还原酶(NL71GM001611)、谷肽甘肽过氧化物酶(NL71GM000375)、超氧化物岐化酶(NL71GM002096)和细胞色素c过氧化物酶(NL71GM000364)。在此基础上,结合细胞生理生化和代谢流探讨了上述差异基因所对应的生物学功能。
【关键词】：木糖酸 全细胞催化 氧化葡萄糖酸杆菌 抑制物 分子机制
【学位授予单位】：南京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;O643.31
【目录】：

• 致谢3-4
• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 1 前言10-12
• 1.1 研究背景10
• 1.2 立题依据10-12
• 2 文献综述12-21
• 2.1 木糖酸12-14
• 2.1.1 木糖酸12
• 2.1.2 木糖酸的功能与用途12-13
• 2.1.3 木糖酸的合成13-14
• 2.2 氧化葡萄糖酸杆菌14-17
• 2.2.1 微生物学基础14
• 2.2.2 基因组研究14-15
• 2.2.3 脱氢酶系统15-17
• 2.3 木质纤维素生物转化抑制物17-18
• 2.3.1 抑制物及形成17-18
• 2.3.2 发酵抑制机制18
• 2.4 转录谱与分子机制研究18-21
• 2.4.1 转录组与转录组学概述及研究意义18-19
• 2.4.2 利用RNA-Seq技术的转录组学研究19
• 2.4.3 转录组测序结果的RQ-PCR验证19-21
• 3 典型抑制物条件下木糖酸全细胞催化反应动力学21-29
• 3.1 实验材料21-22
• 3.1.1 菌种21
• 3.1.2 试剂21
• 3.1.3 主要仪器21-22
• 3.1.4 培养基22
• 3.2 实验方法22-23
• 3.2.1 菌种培养与全细胞催化22
• 3.2.2 糖-糖酸的测定22-23
• 3.2.3 甲酸、糠醛的定量分析23
• 3.2.4 对羟基苯甲醛的定量分析23
• 3.3 结果与讨论23-28
• 3.3.1 甲酸对木糖酸全细胞催化合成的抑制23-25
• 3.3.2 糠醛对木糖酸全细胞合成的抑制25-26
• 3.3.3 对羟基苯甲醛对木糖酸全细胞催化合成的抑制26-28
• 3.4 小结28-29
• 4 氧化葡萄糖酸杆菌基因组测序29-40
• 4.1 实验材料29-30
• 4.1.1 菌种29
• 4.1.2 试剂29
• 4.1.3 主要仪器29
• 4.1.4 培养基29
• 4.1.5 16S rDNA引物29-30
• 4.2 实验方法30-31
• 4.2.1 菌种培养30
• 4.2.2 基因组DNA提取及检测30
• 4.2.3 16S rDNA PCR30
• 4.2.4 基因组测序30
• 4.2.5 基因组序列的组装30-31
• 4.2.6 基因组的组分预测31
• 4.2.7 基因预测、注释与功能分析31
• 4.3 结果与讨论31-39
• 4.3.1 基因组DNA样品质量检测31-32
• 4.3.2 16S rDNA细菌菌种鉴定32-33
• 4.3.3 基因组测序结果数据概况33-34
• 4.3.4 基因组概况34-36
• 4.3.5 基因组组分分析36-37
• 4.3.6 基因功能分析37-39
• 4.4 小结39-40
• 5 典型抑制物木糖酸全细胞催化转录谱比较研究40-50
• 5.1 实验材料40
• 5.1.1 菌种40
• 5.1.2 试剂40
• 5.1.3 主要仪器40
• 5.1.4 培养基40
• 5.2 实验方法40-41
• 5.2.1 菌种培养与全细胞催化40
• 5.2.2 RNA的提取40
• 5.2.3 Total RNA样品质量检测40-41
• 5.2.4 转录组测序41
• 5.3 结果与讨论41-49
• 5.3.1 G. oxydans NL71样品制备41
• 5.3.2 G. oxydans NL71样品质量分析41-42
• 5.3.3 RNA-Seq文库制备及测序42
• 5.3.4 测序数据结果统计42-43
• 5.3.5 Reads与参考基因组比对情况统计43-44
• 5.3.6 基因表达水平分析44
• 5.3.7 差异表达分析44-46
• 5.3.8 基于GO、KEGG的差异基因分析46-48
• 5.3.9 主要差异基因的筛选48-49
• 5.4 小结49-50
• 6 差异基因实时荧光定量PCR验证50-61
• 6.1 实验材料50
• 6.1.1 菌种50
• 6.1.2 试剂50
• 6.1.3 主要仪器50
• 6.1.4 培养基50
• 6.2 实验方法50-52
• 6.2.1 RQ-PCR引物设计50-51
• 6.2.2 菌种培养与全细胞催化51
• 6.2.3 RNA提取51
• 6.2.4 RNA样品质量检测51
• 6.2.5 RNA反转录为cDNA51
• 6.2.6 普通PCR反应51
• 6.2.7 RQ-PCR反应51-52
• 6.3 结果与讨论52-60
• 6.3.1 RQ-PCR基因的引物设计及验证52-54
• 6.3.2 相对标准曲线的绘制54-56
• 6.3.3 RQ-PCR验证结果56-60
• 6.4 小结60-61
• 7 结论与展望61-63
• 7.1 结论61-62
• 7.2 展望62-63
• 攻读学位期间发表的学术论文63-64
• 附录64-65
• 参考文献65-71

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本文编号：1014036