碱处理超滤法提纯透明质酸钠

发布时间：2017-10-12 17:25

  本文关键词：碱处理超滤法提纯透明质酸钠

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【摘要】：以透明质酸钠(SH)粗品为原料,采用Na OH溶液碱化处理后再经过超滤得到医用级SH纯品。采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)法表征SH纯品结构,稀溶液粘度法测定SH纯品粘均分子量,热重分析(TG)法测定SH纯品热稳定性,紫外分光光度计测定SH纯品葡萄糖醛酸含量,库马斯亮蓝法测定SH纯品蛋白质含量,紫外分光光度计测定SH纯品核酸含量,MTT细胞计数和显微观察法测试SH纯品的体外HEK293细胞毒性。正交设计实验和单因素实验,研究碱处理反应温度、反应时间和Na OH溶液浓度对SH纯品各项指标(葡萄糖醛酸含量、蛋白质含量、核酸含量、粘均分子量和产率)的影响程度和机理,筛选出符合医用标准的SH纯品。通过平板菌落计数法对去除菌体前后样品计数研究碱处理超滤工艺去除SH粗品中添加的菌体情况,通过传统半数组织细胞感染量TCID50法和荧光定量PCR(qPCR)方法分别研究碱处理超滤工艺去除SH粗品中添加的病原体情况。研究结果表明:碱处理反应温度是影响SH纯品粘均分子量的关键因素,碱处理反应温度在60℃左右,可以得到高分子量的SH纯品,继续升高碱处理反应温度,SH纯品粘均分子量和产率下降明显。而碱处理反应温度对SH纯品蛋白质含量和核酸含量却没有太大的影响,表明在一定的碱处理反应时间后,SH粗品中的杂蛋白及其核酸得到充分的降解。NaOH溶液浓度对SH纯品的葡萄糖醛酸含量影响较大,当Na OH溶液质量百分比浓度为0.2%时(70℃,90 min),SH纯品葡萄糖醛酸含量达到46.17%,而粘均分子量为1.49×106,蛋白质含量为0.04%,核酸OD值为0.63,产率为40.75%,继续增加Na OH溶液浓度,SH纯品葡萄糖醛酸含量以及产率下降明显,表明葡萄糖醛酸受到破坏。反应时间对SH纯品蛋白质和核酸含量影响最明显,随反应时间增加,SH粗品中更多的杂蛋白以及核酸分子降解成小分子并被超滤掉。因此,提纯SH粗品的最佳碱处理反应条件是:碱处理反应温度为60℃,反应时间为60 min,Na OH溶液质量百分比浓度为0.2%;所提纯的SH纯品葡萄糖醛酸含量为46.87%,而粘均分子量为1.60×106,蛋白质含量为0.05%,核酸OD值为0.33,产率为65.35%,达到医用SH纯品标准。此最佳SH纯品的FTIR谱图与SH标准谱图一致,热分解反应温度为210.5℃,体外对HEK293细胞无明显毒性。碱处理超滤工艺通过碱处理杀灭并分解细菌成小分子物质,再经过超滤除去,达到了有效灭菌的效果。传统TCID50病毒过半数死亡实验结果显示:碱处理超滤工艺通过碱处理灭活病原体后再经超滤除去,SH纯品中几乎没有病原体存在。同时实验结果显示SH纯品经过qPCR反应得到的扩增曲线是一条平直线,说明没有DNA扩增,对照病毒梯度浓度的曲线可以看出没有基因残留,表明碱化超滤处理去除病毒的效果非常理想。以Na OH碱化水解处理SH粗品中杂蛋白、核酸、细菌和病毒成分,再通过超滤方法可以得到SH纯品。与CTAB方法和氯苯酶解方法相比,该提纯方法工艺操作流程简单,解决了目前SH提纯工艺复杂的问题;此外,碱处理超滤法提纯的SH产品纯度高,粘均分子量高,残余蛋白质及核酸含量极低,无细菌和病毒,达到医用SH纯品标准,具有医学领域应用前景。
【关键词】：透明质酸钠 碱处理超滤法 粘均分子量 葡萄糖醛酸 蛋白质 核酸
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O636
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-10
• 第一章 前言10-22
• 1.1 SH概述10-12
• 1.1.1 SH的结构10-11
• 1.1.2 影响SH性能的因素11-12
• 1.1.3 SH的来源12
• 1.2 SH在医学上的应用12-16
• 1.2.1 医学美容整形12-14
• 1.2.2 骨科14-15
• 1.2.3 腹盘腔外科15-16
• 1.3 SH的提纯及检验方法16-20
• 1.3.1 SH的提纯方法16-17
• 1.3.1.1 碱处理超滤16
• 1.3.1.2 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）沉淀法16
• 1.3.1.3 氯苯酶解法16
• 1.3.1.4 其他方法16-17
• 1.3.2 SH的结构与纯度检验方法17-18
• 1.3.2.1 粘度与分子量17-18
• 1.3.2.2 葡萄糖醛酸含量18
• 1.3.2.3 核酸OD值18
• 1.3.2.4 蛋白质含量18
• 1.3.3 菌体与病原体检验方法18-20
• 1.3.3.1 菌体检验方法18-19
• 1.3.3.2 病原体检验方法19-20
• 1.4 本课题研究的目的和意义20
• 1.5 本课题研究的内容和方法20-21
• 1.5.1 研究内容20-21
• 1.5.2 研究方法21
• 1.6 本课题创新点21-22
• 第二章 实验方法22-35
• 2.1 实验试剂22-23
• 2.2 实验仪器23-24
• 2.3 CTAB法提纯SH24
• 2.4 氯苯酶解法提纯SH24
• 2.5 碱处理超滤法提纯SH24-25
• 2.6 纯品结构与热性能表征25-27
• 2.6.1 傅里叶变换红外光谱25
• 2.6.2 葡萄糖醛酸含量25-26
• 2.6.3 粘度及分子量26-27
• 2.6.4 热重分析27
• 2.7 纯品纯度指标分析27-28
• 2.7.1 核酸OD值27
• 2.7.2 蛋白质含量27-28
• 2.8 纯品体外HEK293细胞毒性试验28-29
• 2.8.1 定性评价28
• 2.8.2 MTT法实验操作过程28-29
• 2.9 平板菌落计数法对去除菌体前后样品计数29-30
• 2.10 采用半数组织细胞感染量（TCID50）对去除病原体前后样品计数30-32
• 2.11 QPCR去除病原体前后样品对照32-35
• 第三章 结果与讨论35-75
• 3.1 碱处理超滤反应条件对纯品结构及纯度的影响35-51
• 3.1.1 正交实验影响因素分析35-39
• 3.1.2 反应温度对产物结构及纯度的影响39-45
• 3.1.2.1 红外光谱分析39-41
• 3.1.2.2 热重分析41-42
• 3.1.2.3 粘度及分子量42
• 3.1.2.4 葡萄糖醛酸含量42-43
• 3.1.2.5 核酸OD值43-44
• 3.1.2.6 蛋白质含量44
• 3.1.2.7 产率44-45
• 3.1.3 反应碱溶液质量百分比浓度对纯品结构及纯度的影响45-48
• 3.1.3.1 粘度及分子量45
• 3.1.3.2 葡萄糖醛酸含量45-46
• 3.1.3.3 核酸OD值46-47
• 3.1.3.4 蛋白质含量47
• 3.1.3.5 产率47-48
• 3.1.4 反应时间对纯品结构及纯度的影响48-51
• 3.1.4.1 粘度及分子量48-49
• 3.1.4.2 葡萄糖醛酸含量49
• 3.1.4.3 核酸OD值49-50
• 3.1.4.4 蛋白质含量50-51
• 3.1.4.5 产率51
• 3.2 与传统提纯方法在纯品结构与纯度上的比较51-61
• 3.2.1 与CTAB提纯方法比较51-56
• 3.2.1.1 红外光谱分析51-52
• 3.2.1.2 热重分析52-53
• 3.2.1.3 葡萄糖醛酸含量53
• 3.2.1.2 粘度及分子量53-54
• 3.2.1.5 蛋白质含量54-55
• 3.2.1.6 核酸OD值55
• 3.2.1.7 产率55-56
• 3.2.2 与氯苯酶解提纯方法的比较56-61
• 3.2.2.1 红外光谱分析56-57
• 3.2.2.2 热重分析57
• 3.2.2.3 葡萄糖醛酸含量57-58
• 3.2.2.4 粘度及分子量58-59
• 3.2.2.5 蛋白质含量59
• 3.2.2.6 核酸OD值59-60
• 3.2.2.7 产率60-61
• 3.3 体外HEK293细胞毒性实验结果61-62
• 3.4 碱处理超滤法去除菌体的效果62-66
• 3.4.1 菌落图62-64
• 3.4.2 碱处理超滤工艺去除SH粗品中添加的大肠杆菌效果64
• 3.4.3 碱处理超滤工艺去除SH粗品中添加的金色葡萄球菌效果64-66
• 3.5 碱处理超滤法去除病原体的效果66-75
• 3.5.1 两种处理方法下纯品中病原体情况66-67
• 3.5.2 半数组织细胞感染量（TCID50）分析碱处理超滤法去除病原体67
• 3.5.3 q PCR分析碱处理超滤法去除病原体效果引物的设计和PCR67-75
• 第四章 结论与建议75-77
• 4.1 结论75-76
• 4.2 建议76-77
• 参考文献77-85
• 附录85-87
• 致谢87-88
• 攻读硕士学位期间的研究成果88

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本文编号：1019981