“盖子”区域带电氨基酸及C-端肽链对脂肪酶HL1232催化活性及选择性的调控研究

发布时间：2017-10-13 16:02

  本文关键词：“盖子”区域带电氨基酸及C-端肽链对脂肪酶HL1232催化活性及选择性的调控研究

  更多相关文章： 脂肪酶 定点突变 盖子结构 C-端肽链 酶学性质 生物信息学

【摘要】：HL1232脂肪酶(又称PLA1),是由Thermomyces lanuginosus lipase基因和Fusarium oxysporum phospholipase基因融合并重组表达获得的。该酶不仅表现出脂肪酶活性,同时还具有磷脂酶活性。HL1232脂肪酶空间结构中的“盖子”使其表现出界面激活效应。“盖子”结构的不同状态,决定了该脂肪酶是否具有催化底物水解活性。本文以HL1232脂肪酶为研究对象,在本实验室之前的工作基础上,通过对其“盖子”区域的三个带电荷氨基酸位点进行进一步定点突变研究,对这三个关键氨基酸在HL1232脂肪酶性质与功能中的作用进行了更为深入的研究。另外,磷脂酶活力是HL1232脂肪酶的一个重要性质,该脂肪酶能催化磷脂底物水解的特性使其被广泛用于油脂脱胶工业中。通过对HL1232脂肪酶氨基酸序列进行分析及比对,我们对C-端肽链在HL1232脂肪酶磷脂酶活力表现中的作用进行了研究。论文的具体内容及结果如下:1,“盖子”区域带电荷氨基酸在酶催化活性中的影响研究。在本实验室之前的工作基础上,补加了对R81,R84及E87位点的单点突变,根据氨基酸性质,将该三位点氨基酸残基分别突变成带相反电荷氨基酸,即设计突变体R81E,R84E及E87R;并在单点突变体的研究基础上,设计了多点突变体R81AR84M,R81AE87Q,R84ME87Q及R81AR84ME87Q,以全面研究该三位点不同氨基酸特性对HL1232脂肪酶酶学性质的影响;利用定点突变技术,以实验室构建的野生型表达载体pGAPZaA-HL1232出发,构建各突变体表达载体,并成功在毕赤酵母X-33中重组表达。发酵上清液经Q阴离子交换柱分离纯化,获得纯化野生型及突变体重组蛋白。以纯化的HL1232脂肪酶野生型及其突变体为研究对象,分别测定各突变体水解橄榄油底物与大豆卵磷脂底物的酶学性质。结果显示,R84E突变体水解两种底物的酶活力较野生型都有所上升;R81E突变体酶活力则与野生型相差不大,且其水解两种底物的最适反应条件相同,均为pH6.0,45℃;而E87R突变体的比酶活有所下降,且其反应的最适温度发生了巨大变化,其水解橄榄油底物及卵磷脂底物的最适反应温度由野生型的45℃、55℃分别下降至30℃、45℃。分析各多点突变体,虽然其单点突变酶活力均有很大程度提升,但除R81AE87Q外,其他三个多点突变体的比酶活均比野生型低,多点突变的酶学性质的改变不是单点突变的简单累加结果。2,C-端肽链在酶底物选择性中的作用研究。根据HL1232脂肪酶序列分析,设计了突变体D263-317,D270-317,S263-269及S263-269D270-317,对该段C-端肽链进行替换或缺失,以定向研究该段肽链在HL1232脂肪酶表现磷脂酶活力中的作用;并在此基础上,以263-269氨基酸残基片段中的唯一带电荷氨基酸残基D266为对象,设计了突变体D266A,D266E,D266E,以研究该位点在HL1232脂肪酶性质与功能中的作用。构建各突变体表达载体,并使其在毕赤酵母中成功重组表达。目的蛋白突变体经纯化后,分别测定各突变体水解橄榄油底物与大豆卵磷脂底物的酶学性质。结果显示,HL1232脂肪酶的C-端肽链的缺失或替换,其酶学性质发生了很大变化。D263-317和S263-269突变体水解大豆卵磷脂的最适pH均由野生型的酸性条件(pH 5.0)变成了中性条件(pH 7.0),且S263-269突变体水解橄榄油底物的最适pH由中性条件(pH 7.0)上升为pH 9.0,D263-317水解两种底物的比酶活大大降低。263-269氨基酸胺基片段的替换会改变该脂肪酶对水解磷脂底物与三酯底物的偏好性。各C-端肽链突变体的PL/TG均发生巨大变化,由野生型的0.828分别下降为0.802(D263-317),0.601(D270-317),0.328(S263-269),0.115(S263-269D270-317)。3,通过生物信息学的进一步分析发现,“盖子”区域氨基酸残基与周围氨基酸残基及外界环境间的相互作用(包括Cation-π,氢键,盐桥,疏水相互作用等)对“盖子”结构构象的转变起着重要的作用,这些相互作用力影响“盖子”结构的灵活性,并影响其闭合状态或开放状态的稳定性,进而影响该酶的催化效率;HL1232脂肪酶C-端肽链为其催化中心营造的极性环境可能是其具有磷脂酶活力的原因之一。
【关键词】：脂肪酶 定点突变 盖子结构 C-端肽链 酶学性质 生物信息学
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O629.8
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 绪论12-23
• 1.1 脂肪酶简介12-18
• 1.1.1 脂肪酶定义12
• 1.1.2 脂肪酶的结构基础及催化机制12-17
• 1.1.3 脂肪酶的磷脂酶活性17
• 1.1.4 脂肪酶的分子改造17-18
• 1.2 HL1232脂肪酶简介18-20
• 1.2.1 HL1232脂肪酶的蛋白序列信息18-19
• 1.2.2 HL1232脂肪酶的结构基础19
• 1.2.3 HL1232脂肪酶的应用19-20
• 1.3 立题背景与意义20-21
• 1.4 研究内容及研究路线21-23
• 1.4.1 研究内容21
• 1.4.2 技术路线21-23
• 第二章“盖子”区域带电荷氨基酸对HL1232脂肪酶酶学性质的影响研究23-48
• 2.1 引言23
• 2.2 实验材料和仪器23-28
• 2.2.1 菌株与载体23
• 2.2.2 试剂23-24
• 2.2.3 常用实验仪器24-25
• 2.2.4 培养基及溶液的配制25-28
• 2.3 实验方法28-36
• 2.3.1 突变体设计28
• 2.3.2 突变体表达载体构建28-33
• 2.3.3 HL1232脂肪酶突变体的表达与纯化33-34
• 2.3.4 HL1232脂肪酶突变体酶学性质测定34-36
• 2.4 结果与讨论36-47
• 2.4.1 引物设计36-37
• 2.4.2 HL1232脂肪酶突变体大肠杆菌DH5a菌株的筛选与鉴定37-38
• 2.4.3 HL1232脂肪酶突变体毕赤酵母X-33 表达菌株的筛选与鉴定38
• 2.4.4 HL1232脂肪酶突变体的表达与纯化38-39
• 2.4.5 脂肪酶HL1232突变体最适反应pH测定39-42
• 2.4.6 HL1232脂肪酶突变体最适反应温度测定42-44
• 2.4.7 HL1232脂肪酶“盖子”区域带电荷氨基酸残基酶学性质汇总44-47
• 2.5 本章小结47-48
• 第三章 C-端肽链在HL1232脂肪酶底物选择性中的作用研究48-61
• 3.1 引言48
• 3.2 实验材料和仪器48
• 3.3 实验方法48-50
• 3.3.1 突变体设计48-49
• 3.3.2 突变体表达载体构建、发酵表达及纯化49-50
• 3.3.3 突变体酶学性质测定50
• 3.4 结果与讨论50-60
• 3.4.1 引物设计50
• 3.4.2 HL1232脂肪酶突变体大肠杆菌DH5a菌株的筛选与鉴定50-51
• 3.4.3 HL1232脂肪酶突变体毕赤酵母X-33 表达菌株的筛选与鉴定51-52
• 3.4.4 HL1232脂肪酶突变体的表达与纯化52-53
• 3.4.5 脂肪酶HL1232突变体最适反应pH测定53-56
• 3.4.6 HL1232脂肪酶突变体最适反应温度测定56-58
• 3.4.7 脂肪酶HL1232 C-端肽链定向改造突变体酶学性质结果总结58-60
• 3.5 本章小节60-61
• 第四章 HL1232脂肪酶及其突变体生物信息学分析61-75
• 4.1 引言61
• 4.2 HL1232脂肪酶生物信息学分析及模型构建61-65
• 4.2.1 HL1232脂肪酶氨基酸序列分析61-63
• 4.2.2 HL1232脂肪酶模型构建63-64
• 4.2.3 HL1232脂肪酶模型评估64-65
• 4.3 HL1232脂肪酶“盖子”区域与其酶活力关系65-71
• 4.3.1“盖子”区域突变体与野生型酶活力对比65
• 4.3.2“盖子”区域突变体结构分析65-71
• 4.4 C-端肽链与HL1232脂肪酶磷脂酶活力关系71-73
• 4.4.1 C-端肽链定向改造相关突变体与野生型酶学性质对比71-72
• 4.4.2 C-端肽链在脂肪酶HL1232水解磷脂底物作用中的生物信息学分析72-73
• 4.5 本章小结73-75
• 结论与展望75-77
• 结论75
• 创新点75
• 展望75-77
• 参考文献77-83
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果83-84
• 致谢84-85
• 附件85

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 付敏;赵谋明;刘宁;仇超颖;赵强忠;;固定化磷脂酶Lecitase~ Ultra催化合成果糖月桂酸单酯的研究[J];现代食品科技;2012年09期

2 赵梦梦;薛正莲;黄祖耀;苏燕南;马琦亚;;三种磷脂酶A1活力测定方法的比较[J];食品与发酵科技;2012年03期

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本文编号：1025760