毛细管在线富集技术在蛋白激酶活性检测中的应用

发布时间：2017-10-19 08:02

  本文关键词：毛细管在线富集技术在蛋白激酶活性检测中的应用

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【摘要】：激酶催化蛋白磷酸化是一种将三磷酸腺苷(ATP)分子上γ-磷酸基团转移至蛋白或多肽底物序列中含有丝氨酸、酪氨酸或是苏氨酸残基上的蛋白质翻译后修饰过程,它在生物体的各项生命活动中起到至关重要的作用,如细胞间信号传导和细胞内的生命过程(生长、分化、增殖、凋亡等)。在真核细胞中,用于编码蛋白激酶的基因占总基因数的1-3%,而蛋白激酶的活性异常或是过表达与许多已知的疾病如炎症、癌症、糖尿病、老年痴呆症等紧密相关。因此,通过测定特定激酶的活性不仅有益于推动基础生命化学的研究进程,而且对于理解与激酶相关疾病机理有重要意义,并对生物诊断治疗和抗增生药物研发具有重要作用。传统检测蛋白激酶活性的方法主要是放射性方法和基于抗体-抗原特异性作用的免疫分析法,但这两种方法存在着不足之处。其中放射性方法过程中涉及到对人类有害的放射性污染物,免疫分析方法的分析成本较高且缺少具有特异性识别的抗体。因此,新型激酶分析方法陆续被开发出来,如荧光方法、电化学方法、表面等离子体共振方法、质谱分析方法等。这些方法虽然各具一定的优势,但是也常常涉及到标记、孵育、清洗、检测等多步过程,耗时耗力。因此发展高效通用的激酶分析方法对于分析工作者依然是一个挑战。综合上述考虑,本文基于毛细管在线富集技术的优异富集性能和毛细管电泳分析方法的高自动化及高效分离能力,实现了对蛋白激酶活性及其对应的激酶抑制剂的高灵敏度检测和筛选。主要内容如下：1、基于非连续电解质毛细管等速电泳技术(CITP)设计了一种在线间接检测了蛋白激酶PKA活性的电泳分析方法平台。毛细管等速电泳不仅具有较高的分析效能,而且常常作为一种在线富集手段用以提高毛细管电泳分析方法的灵敏度。由于PKA激酶催化产生的微量磷酸化多肽经由等速电泳技术在线富集之后被高效分离检测,因此该方法的最低检测限达到了12.5mU/μL,相较传统的CZE的最低检测限50 mU/μL降低了约4倍,大大提高了该方法分析激酶活性时的检测灵敏度。由于该方法结合了电泳分析方法的自动化和程序化等优点,所以在高通量分析激酶活性或筛选激酶特定抑制剂有着巨大的应用潜能。2、基于毛细管在线等电聚焦技术(on-line CIEF)在线富集磷酸化的多肽并高灵敏高效分析PKA蛋白激酶活性。毛细管等电聚焦不仅具有较高的分辨率,而且常常被用于作为一种高效富集手段用以提高毛细管电泳方法的灵敏度。在该方法中,分析PKA蛋白激酶活性时的最低检测限为1.25mU/μL,较传统CZE降低了约40倍,充分表明了on-line CIEF高灵敏度分析的特性。3、基于在线等电聚焦技术不仅具有较高的检测灵敏度而且还具有较高的分离度,因此我们实现了多种激酶的同时分析及其抑制剂筛选并且检测实际细胞裂解液中激酶的活性。其中对PKA和CDK1两种激酶各自特异性抑制剂H-89、Ro-3306的抑制活性进行了评估,其IC5o值分别为37.0 nM、35.9 nM。实验表明,on-line CIEF方法平台不仅可以实现多种激酶活性的同时分析及其特定抑制剂的高效筛选,而且还可以用于检测实际样品细胞裂解液中PKA激酶的活性。
【关键词】：毛细管在线富集技术 等电聚焦 等速电泳 蛋白激酶 激酶抑制剂 高通量筛选
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q55;O657.8
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 绪论12-27
• 1.1 毛细管电泳技术概述12-13
• 1.2 毛细管电泳在线富集技术13-18
• 1.2.1 样品堆积技术13-16
• 1.2.2 样品扫集技术16
• 1.2.3 毛细管等速电泳技术16-17
• 1.2.4 毛细管等电聚焦17-18
• 1.2.5 在线固相富集技术18
• 1.3 蛋白质翻译后修饰18-25
• 1.3.1 蛋白磷酸化修饰19-20
• 1.3.2 蛋白激酶活性检测及其抑制剂筛选20
• 1.3.3 基于比色法检测激酶活性20-22
• 1.3.4 基于荧光方法检测激酶活性22-23
• 1.3.5 基于电化学检测激酶活性23-24
• 1.3.6 基于毛细管电泳技术检测激酶活性24-25
• 1.4 本文构思25-27
• 第2章 非连续电解质毛细管等速电泳在线富集磷酸化多肽间接检测激酶活性27-35
• 2.1 前言27-28
• 2.2 实验部分28-29
• 2.2.1 试剂与材料28-29
• 2.2.2 仪器29
• 2.2.3 CITP分析PKA催化的多肽底物和产物29
• 2.2.4 PKA激酶催化多肽磷酸化29
• 2.2.5 CITP检测PKA激酶活性29
• 2.3 结果和讨论29-34
• 2.3.1 CITP分析PKA多肽29-30
• 2.3.2 CITP条件优化30-33
• 2.3.2.1 前导电解质体系中离子种类的优化30-31
• 2.3.2.2 前导电解质浓度的优化31-32
• 2.3.2.3 进样时间条件优化32
• 2.3.2.4 分离电压条件优化32-33
• 2.3.3 不同电泳方法检测PKA多肽的比较33
• 2.3.4 激酶工作曲线的建立33-34
• 2.4 小结34-35
• 第3章 毛细管等电聚焦在线高灵敏度检测PKA激酶活性35-43
• 3.1 前言35-36
• 3.2 实验试剂、材料与仪器36-37
• 3.2.1 实验试剂、材料36
• 3.2.2 实验仪器36
• 3.2.3 毛细管等电聚焦用的中性毛细管的制备36-37
• 3.2.4 毛细管等电聚焦在线分析PKA催化的多肽底物和产物37
• 3.2.5 PKA激酶催化多肽磷酸化37
• 3.2.6 毛细管等电聚焦检测PKA激酶活性37
• 3.3 结果和讨论37-42
• 3.3.1 On-line CIEF分析PKA多肽37-38
• 3.3.2 条件优化38-40
• 3.3.3 不同电泳方法检测PKA多肽40-41
• 3.3.4 激酶工作曲线的建立41-42
• 3.4 小结42-43
• 第4章 在线等电聚焦同时分析多种激酶及其抑制剂筛选并高灵敏度检测细胞裂解液中的激酶活性43-53
• 4.1 前言43-44
• 4.2 实验部分44-46
• 4.2.1 试剂和材料44-45
• 4.2.2 实验仪器设备45
• 4.2.3 毛细管在线等电聚焦结合激光诱导荧光检测分析45
• 4.2.4 同时检测激酶活性和激酶抑制剂筛选45
• 4.2.5 细胞裂解液中细胞激酶活性分析45-46
• 4.3 结果和讨论46-51
• 4.3.1 在线等电聚焦富集分析双重激酶催化多肽混合物46-47
• 4.3.2 双重激酶活性检测47-48
• 4.3.3 激酶抑制剂活性分析48-50
• 4.3.4 癌细胞裂解液中蛋白激酶活性检测50-51
• 4.4 本章小结51-53
• 结论53-54
• 参考文献54-62
• 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录62-63
• 致谢63

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本文编号：1059942