基于超电荷绿色荧光蛋白的新分析方法研究

发布时间：2017-11-08 10:17

  本文关键词：基于超电荷绿色荧光蛋白的新分析方法研究

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【摘要】：超电荷绿色荧光蛋白(supercharged green fluorescent protein, scGFP)是一类表面有很高静电荷的绿色荧光蛋白,它们具有比普通的绿色荧光蛋白更优的性质,如荧光稳定性好、不易聚集、抗盐能力强、耐受pH能力强等。带有超多正电荷的绿色荧光蛋白可以穿透细胞膜,运载DNA、siRNA等生物大分子进入细胞。由于以上优点,scGFP在生物化学领域引到了越来越广泛的关注。利用scGFP带电荷的性质及其发荧光的性质,可以基于scGFP构建传感分析平台用于生化分析。本文基于scGFP开发了一种无标记检测PARP-1活性的新方法。另外,还设计、构建了一种对MMP-2敏感的荧光探针。具体工作如下：1、实验室前期研究发现+36GFP与GO通过静电作用和π-π堆积作用而结合,+36GFP的荧光几乎全部被GO淬灭,而当加入适当长度的DNA时,DNA会与+36GFP通过静电作用结合,形成+36GFP/DNA复合物,保护+36GFP的荧光不被GO淬灭。利用聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1 (poly(ADP-ribose) polymerase-1, PARP-1)在损伤DNA的激活下催化发生聚腺苷二磷酸核糖化产生的聚腺苷二磷酸核糖(PAR)带大量负电荷的性质,构建了一种基于+36GFP/GO相互作用无标记检测PARP-1活性的新方法。带负电的PAR与+36GFP通过静电作用结合,形成+36GFP/PAR复合物可以有效地抑制GO对+36GFP荧光的淬灭,体系荧光信号的强度直接反映PARP-1的活性,简单,快速,直接,灵敏度高,检测限可达0.002 U/μL,在0.002-0.07 U/μL范围内有很好的线性关系,为PARP-1酶活性检测提供了一个新思路,该方法还可用于PARP-1抑制剂的筛选。2、实验室前期根据增强型绿色荧光蛋白(enchanced green fluorescence protein, EGFP)的结构特性,通过His-tag和Ni2+的配位作用在整体柱上螯合EGFP形成微酶反应系统,利用凝血酶对凝血酶底物进行在线消化释放EGFP,结合毛细管电泳激光诱导荧光检测技术(capillary electrophoresis-laser-induced fluorescence detection, CE-LIFD),实现对凝血酶的在线检测。基质金属蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2, MMP-2)是降解IV型胶原最重要的蛋白酶之一,它能促进肿瘤的侵袭和迁移,与肿瘤的发生密切相关。这里,以-30GFP作为荧光报告分子,构建对MMP-2敏感的荧光探针MMP-2S-30GFP,探针包括三个部分：N端His-tag,中间MMP-2特异性识别序列(MMP-2 Susbstrate, MMP-2S),C端荧光报告分子-30GFP。通过全基因人工合成法获得携带有MMP-2S-30GFP基因的质粒pUCK-mmp-2s-30gfp,用“两步法”和“一锅法”得到适用于表达的重组质粒pET28a-mmp-2s-30gfp,将重组质粒转入大肠杆菌IPTG诱导表达,通过镍柱纯化得到高纯度的对MMP-2敏感的荧光探针MMP-2S-30GFP,通过变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)、紫外吸收光谱和荧光光谱对其进行表征。为之后与毛细管电泳技术相结合,发展一种高灵敏新型在线检测MMP-2的新方法打下坚实的基础,为利用不同超电荷荧光蛋白荷质比不同实现多种酶的同时在线检测提供了思路。
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.3

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