蛋白质组学微量样本的制备与质谱分析技术

发布时间：2017-11-15 18:10

  本文关键词：蛋白质组学微量样本的制备与质谱分析技术

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【摘要】：本论文针对基础与临床蛋白质组研究中,微量蛋白质组样本的制备与质谱分析的需求,开展了两个方面的研究工作：(1)石蜡包埋组织的蛋白质提取与规模化鉴定方法学研究；(2)小鼠肝脏细胞类型的分离纯化。通过福尔马林固定和石蜡包埋,临床病理组织能够获得很好的保存。这些样本具备完善的病理信息及临床跟踪信息,是极好的疾病蛋白质组研究与疾病标志物发现研究对象。为了深入挖掘这些样本所蕴含的生物学与临床价值,一种有效的策略,是针对石蜡包埋组织开展规模化的蛋白质组分析,利用定量研究策略,发现差异表达蛋白质及候选分子标志物。在第一部分的实验内容中,我们建立了包埋组织蛋白质的提取方法。同时,针对回收的微量蛋白质,比较了采用普通胶内酶切和原位凝胶胶内酶切两种方法,开展蛋白质的规模化鉴定。结果显示,福尔马林固定石蜡包埋的鼠肝组织样本经回收后,可以获得与新鲜鼠肝样本表达谱相近的鉴定效果,说明固定和包埋过程对于组织样本的表达谱鉴定没有影响,常规的蛋白质组学分析流程,可以兼容石蜡包埋的鼠肝组织。微量蛋白质组样本处理过程中,需要考虑在去除溶液中的污染小分子的同时、尽量避免样本损失,聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)提供了一个很好的介质。本研究比较了将微量样本,先进行短区间SDS-PAGE分离,以及直接将蛋白质固化到PAGE凝胶两种方法。利用短区间的SDS-PAGE,在一个90 min的质谱梯度中,我们实现了从10μg的Hela全细胞裂解液中鉴定到2931个蛋白。在相同的实验条件下,我们从10μg新鲜冻存鼠肝样本和等量的石蜡包埋鼠肝组织样本中分别鉴定到2301和2264个蛋白,上述结果一方面说明,石蜡包埋组织内的蛋白质可以有效提取,同时,SDS-PAGE胶内酶切技术可以稳定地应用于微量样本蛋白质组分析中。我们比较了用原位凝胶(in-situ PAGE)胶内酶切的方法,来处理上述样本。该方法的特点是,蛋白质混合物在PAGE胶凝固的同时,固化到胶中,后续的小分子污染物清洗和蛋白质酶解,完全等同于SDS-PAGE分离后的样本。因此,in-situ方法,较普通的胶内酶切要简单。基于该方法,分别从10μg的人Hela细胞裂解液、新鲜冻存鼠肝样本、石蜡包埋鼠肝样本最高鉴定到2327、2164和2077个蛋白,略低于用胶内酶切达到的鉴定量。但是,in-situ PAGE方法处理后,蛋白质的鉴定量十分稳定,说明in-situ PAGE方法可能更适用于非标记定量的蛋白质组分析应用。针对石蜡包埋组织的分析发现,福尔马林固定并没有对酶切产生不良影响。同时,从总离子流色谱图的肽段洗脱顺序中,我们发现福尔马林固定及石蜡包埋的特殊处理过程,并不会影响肽段混合物的整体亲疏水性分布。这些结果说明石蜡包埋组织块,完整地储存了临床样本中的蛋白质组信息,具备开展规模化分析及候选生物标志物发现的潜力。在第二部分的实验内容中,我们意图将小鼠肝脏实现细胞分类,获得微量的肝脏细胞进行实验,也为后期的分泌蛋白质组及肝脏细胞类型蛋白质组研究奠定基础。我们改进Seglen的胶原法,获得肝脏原位循环灌流的方法,对小鼠肝脏进行灌流和消化,再经过细胞筛过滤,获得了细胞混合悬浮液。进一步用差速离心的方法对细胞混合悬浮液进行分离,我们获得了肝实质细胞与非实质细胞。细胞形态观察和免疫印迹验证证实我们获得了较纯的肝实质细胞与非实质细胞；
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q51;O657.63

【参考文献】

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1 黄凰;杨燕;刘嘉;张振华;田拥军;王宝菊;郝友华;杨东亮;;中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体H1和H2亚基糖基识别域的原核表达及复性[J];医学分子生物学杂志;2006年04期

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本文编号：1190708