立体选择性氧化还原酶催化性能分析及其耦联催化去消旋手性醇的研究

发布时间：2017-12-30 04:21

  本文关键词：立体选择性氧化还原酶催化性能分析及其耦联催化去消旋手性醇的研究　出处：《江南大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：生物法制备手性醇,具有效率高、特异性和立体选择性好以及反应条件温和等优点。本研究从多种不同微生物来源的酶出发,优化诱导条件,得到活性表达的重组酶,构建构建立体选择性氧化还原酶工具箱。并以多种潜手性芳基酮、脂肪酮和酮酯类化合物作为底物,研究其催化性能和规律。以(R,S)-苯基乙二醇(PED)为模式底物,构建双酶耦联催化的去消旋体系,研究去消旋过程中辅酶自循环途径的构建方法,优化反应系统条件,并在此基础上进行(R,S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DHTP)去消旋获得(S)-DHTP的体系构建,具体内容包括:(1)本研究收集了来源于8种微生物的20种立体选择性氧化还原酶,通过对重组蛋白表达条件的研究,优化重组酶的蛋白表达。研究发现,除SCR、CPAR1最佳诱导温度为30℃外,其他重组酶的最佳温度为17℃。CPAR5、CPAR8在2%乳糖的诱导下表达量最高,CR4、KRD、SCR在0.5 mmol×L~(-1) IPTG诱导下表达量最高,其他重组酶的最佳诱导剂为1 mmol×L~(-1) IPTG。对活性表达的重组菌进行破碎收集上清液,通过Ni离子亲和层析法分离纯化得到各电泳纯的重组氧化还原酶。(2)以纯化好的重组酶作为催化剂,进行不对称催化性能考察,用14种潜手性芳基酮、脂肪酮和酮酯类化合物为底物,进行底物特异性、动力学参数、立体选择性研究。研究发现每种立体选择性氧化还原酶都对多种潜手性底物具有活性,从底物角度来看,对于选定的底物,20种立体选择性氧化还原酶表现出较大的差异性,其中对底物2-羟基苯乙酮、2’-氯苯基乙酮、3’-氯苯基乙酮、4-溴苯乙酮、2-辛酮、乙酰乙酸甲酯的催化活力高于其它,而对于底物邻羟基苯乙酮、2-庚酮的催化活力相对较弱。本研究所构建的立体选择性氧化还原酶工具箱具有较宽的底物谱、较优的催化效率和突出的立体选择性,可以比较理想的催化不对称转化反应。(3)以(R,S)-PED为模式底物构建的双酶耦联催化去消旋体系生成(R)-PED。此体系通过耦联两种立体选择性氧化还原酶来构建,这两种酶分别是stereospecific carbonyl reductase 1(SCR1)和ketoreductase(KRD)。为平衡多酶体系中不同酶的活性和催化功能,优化SCR1催化的氧化反应和KRD催化的还原反应的条件。据此,构建出来拥有辅酶自循环体系生产(R)-PED的去消旋体系,在最优反应条件SCR1/KRD活力比为1:4、NADP+/NADPH比例为3:1、30℃、pH 7.0时,有95.50%e.e.光学纯度和91.62%的产率。这一去消旋体系构建方法可以用来构建基于酶学性质系统评价的多酶去消旋体系。(4)根据上文中构建去消旋体系的方法,在(R,S)-DHTP去消旋获得(S)-DHTP的体系构建中,首先筛选获得分别催化氧化反应和还原反应的重组酶stereospecific carbonyl reductase 3(SCR3)和carbonyl reductase 2(CR2),并在对酶催化条件优化的基础上,选择去消旋体系的反应条件为三乙醇胺缓冲液(pH 8.0)、30℃、1 mmol×L~(-1) ZnSO4。据此,构建出拥有辅酶自循环体系的去消旋体系,在最优反应条件SCR3/CR2活力比为1:2、辅酶添加比NADP+/NADPH为3:1时,可从反应体系中获得的(S)-DHTP,产率和光学纯度分别高达89.45%和91.71%e.e.。在底物浓度为4 g×L~(-1)时,产物(S)-DHTP的产率和光学纯度分别为78.29%和86.79%e.e.。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O629.8
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本文编号：1353316