早期冠心病miRNA标志物荧光诊断技术与系统研究

发布时间：2018-05-12 19:01

  本文选题：核酸检测 + 荧光　； 参考：《中国科学技术大学》2017年博士论文

【摘要】：荧光检测在医学检验、食品卫生、动植物检验检疫上应用广泛。利用荧光检测方法对核酸进行定量分析和特异性识别在生物医学上具有重要的意义。核酸中的MicroRNA (miRNA)与生命体发展过程中多种疾病的发生和发展密切相关。在调控时间顺序上,miRNA对基因表达的调控先于蛋白变化,因此,可作为潜在的疾病早期诊断标志物。但是,传统的miRNA检测方法大多操作步骤繁琐,检测时间长,需要使用价格昂贵的检测仪器,操作人员需要专门培训,检测成本高。难以满足快速、即时检测低丰度miRNA的要求。本研究利用miRNA可对某些疾病提前表达的特性,基于滚环扩增(RCA)检测miRNA技术,通过对特异性miRNA进行标记,利用光电检测方法,根据标志物受激发出的荧光强度分析得出miRNA的初始浓度。为特异性miRNA快速、即时检测提供一种新技术,利用此技术开发的miRNA荧光检测系统可为冠心病等慢性疾病提供进行风险分层和早期预警的仪器。研究围绕荧光快速检测,具体做了以下几方面的工作:从荧光产生的机理出发,通过理论分析,计算出采用共焦式荧光检测系统和非共焦式荧光检测系统结构可以产生的荧光光子数。分析出若采用共焦结构,激发光光功率1.2mW,则要求光电探测器最低探测灵敏度不低于2.77×10-7W;若采用非共焦结构,在相同光照强度下,要求光电探测器最低探测灵敏度不低于1.98×10-7W。依据理论计算结果选择非共焦结构中的正入射结构为本研究miRNA荧光检测系统的光学结构。根据miRNA荧光检测特点,系统设计上选择采用滚环扩增(RCA)技术对冠心病特异性miRNA进行扩增,采用SYBR Green Ⅱ荧光染料作为荧光标记物,依据荧光染料参数选择相应的光源为发光二极管(LED),探测器为光电倍增管(PMT)。根据滚环扩增(RCA)方式和荧光检测结构特点,通过理论计算,选择使用半导体加热作为miRNA荧光检测系统的加热方式。通过对激发光光束进行光学整形设计,使其满足系统的应用要求。对样品池进行设计,使其既利于滚环扩增(RCA)反应,又方便荧光信号探测,且隔绝了不同样品之间荧光信号的串扰。最后,通过软件设计,完成数据处理及人机交互。通过设计相应的验证实验,获得miRNA荧光检测系统的多项技术指标。得出miRNA荧光检测系统荧光强度线性偏倚不超过±5%、重复性不低于95%、系统最低检出限为12个拷贝等指标。使用miRNA荧光检测系统,对从心肌细胞中提取的冠心病标志物miR-499进行滚环扩增(RCA)。从检测结果可以看出,miRNA荧光检测系统可以满足冠心病特异性miRNA实时检测的目的。实验得出通过合理设置滚环扩增反应条件,冠心病特异性miRNA检测所需时间低于30分钟。通过验证实验得出miRNA荧光检测系统检测灵敏度与实时荧光定量PCR仪灵敏度相近,但miRNA荧光检测系统检测miRNA所需时间远低于实时荧光定量PCR仪检测miRNA所需时间。这为特异性miRNA快速、即时检测提供了一种有价值的检测技术。miRNA荧光检测系统采用正交式检测结构,通过整体设计,降低系统背景光噪声,提高荧光采集效率,实现微弱荧光采集,为生物荧光检测提供一种小型化设计的检测方案。基于miRNA荧光检测技术研发的miRNA荧光检测系统具有成本低、体积小、便于携带,操作简便的特点。不仅可以作为滚环扩增的实验室专用检测设备,也可以作为中小型医疗机构日常检测的常用设备,为慢性疾病如冠心病、癌症等的风险分层、早期预警和病情追踪提供一种新型辅助诊断方法。
[Abstract]:In this paper , we use SYBR Green 鈪，

本文编号：1879774