基于碳纳米材料修饰电极的细胞电化学方法的建立及在污染物毒性评价中的应用

发布时间：2018-06-05 12:18

  本文选题：细胞电化学 + 毒性　； 参考：《东北师范大学》2017年博士论文

【摘要】：水污染已成为全球最为突出的环境问题之一。其中,多种重金属和酚类污染物已被美国环境保护署列为优先控制污染物,它们一般具有分布广、毒性大等特点,其造成的水环境污染及对生物的危害日益受到公众关注和科研工作者重视,利用高效的生物检测技术对其毒性进行早期预警与评价显得极为重要。然而,目前大部分常规体外毒性检测方法具有操作复杂、费时、有毒、费用高等缺点。因此,急需建立简单、快速、无毒、成本低的毒性检测新方法。细胞电化学是近十年发展起来的一个领域,它通过电化学手段对细胞的电化学行为进行分析,进而揭示细胞的结构 功能关系并评价外源物质对细胞产生的影响。与传统体外毒性评价方法相比,细胞电化学方法具有无需标记、无毒、简单、灵敏、快速的特点,已成为细胞活性评价的重要研究手段。该领域的研究主要集中于两方面,一是揭示细胞的电化学响应机理;二是利用新型纳米材料对电极进行修饰以提高检测灵敏度。机理研究方面,目前从核苷酸代谢角度得到的较为清晰的解释是,细胞的电化学响应来源于细胞质中鸟嘌呤和黄嘌呤的氧化反应,且以混合信号的形式存在。与之相比,该领域关于纳米材料修饰电极的研究才刚刚起步。新型纳米材料的出现,有望提高现有电化学信号的响应强度以及产生新的响应信号,从而促进细胞电化学方法的进一步发展。综上,本文以两种碳纳米材料(石墨烯、碳纳米管)为基底材料,制备了多种具有高催化性能的修饰电极,利用扫描电子显微镜(SEM)、X射线光电子能谱(XPS)、X射线衍射分析(XRD)、拉曼光谱、X射线能谱(EDS)、电化学阻抗谱(EIS)、循环伏安法进行了表征。以人宫颈癌(HeLa)细胞和人肝癌(HepG2)细胞为模型,对其电化学行为进行了深入研究,结合高效液相色谱分析揭示了其电化学响应机理,同时跟踪了细胞生长曲线,进而建立了基于不同纳米修饰电极的细胞电化学方法。评价了多种重金属和酚类污染物对细胞活性的影响,并与传统MTT比色法进行了比较。本文为环境污染物毒性评价和水体安全性评价提供了新的技术方法。主要研究结果如下:1.采用电化学还原法制备了石墨烯修饰玻碳电极(ERGO/GCE),避免了常规化学还原操作繁琐、还原剂有毒、条件要求高等问题。电极表征结果显示,电化学还原可有效去除氧化石墨烯的部分含氧官能团,使其电子传递能力及电催化性能明显提高。利用ERGO/GCE对HeLa细胞裂解液的伏安行为进行研究,在+0.68 V位置测得一个明显的氧化峰,结合高效液相色谱分析证实其归因于细胞中鸟嘌呤和黄嘌呤的氧化反应。利用ERGO/GCE描述了HeLa细胞的生长曲线,结果与传统细胞计数法一致。在此基础上,建立了基于ERGO/GCE的细胞电化学方法。利用该方法评价Cr6+、Cd~(2+)、Cu~(2+)、Pb~(2+)、Zn~(2+)对HeLa细胞的毒性,发现其存在显著的时间效应和剂量效应关系,五种重金属的毒性大小顺序为Cr6+Cd~(2+)Cu~(2+)Pb~(2+)Zn~(2+),30 h半数抑制浓度(IC50)分别为5.56、19.68、36.56、57.50、121.00μM。与传统MTT比色法相比,基于ERGO/GCE的细胞电化学方法更为简单、快速、灵敏。2.利用刮涂法制备了碳纳米管-离子液体修饰玻碳电极(MWCNTs-IL/GCE),将电化学检测电位窗由0 +0.80 V扩大至0 +1.10 V。通过表征发现,IL的掺杂降低了MWCNTs的缠绕程度,有效促进了电子转移,MWCNTs-IL/GCE的电化学阻抗值几乎降为零,电活性表面积显著增大。MWCNTs-IL/GCE对HeLa细胞裂解液具有良好的电催化活性,在+0.72 V和+1.03 V处分别检测到归因于鸟嘌呤/黄嘌呤、腺嘌呤/次黄嘌呤的伏安信号。利用该电极对HeLa细胞的生长过程进行了研究,在此基础上建立了基于MWCNTs-IL/GCE的双信号细胞电化学检测方法。评价了2,4-二氯酚(2,4-DCP)、2,4,6-三氯酚(2,4,6-TCP)、五氯酚(PCP)对HeLa细胞的毒性,根据信号Ⅰ和信号Ⅱ的细胞毒性关系曲线得到三种氯酚污染物的IC50值分别为451.76、172.51、75.92μM和495.76、198.53、96.39μM,毒性顺序为PCP2,4,6-TCP2,4-DCP,与MTT比色法所得毒性规律一致。3.通过电化学还原和电聚合方法制备了溴甲酚紫/石墨烯修饰玻碳电极(BCP/erGO/GCE),其中,电化学还原过程可以有效恢复石墨烯的π-π共轭结构,有利于其与BCP分子发生π-π堆积作用,得到的二元复合修饰电极电活性位点增多、电子传递能力增强。BCP/erGO/GCE同样可以检测到HeLa细胞裂解液的两个明显的伏安信号,分别位于+0.62 V和+0.83 V位置。利用该电极研究了HeLa细胞的生长曲线,进而建立了基于BCP/erGO/GCE的双信号细胞电化学方法。对五种重金属(Cr6+、Cd~(2+)、Cu~(2+)、Pb~(2+)、Zn~(2+))的毒性进行检测,根据信号Ⅰ和信号Ⅱ得到的IC50值分别为4.53、15.45、26.36、52.20、101.86μM和7.06、21.32、35.81、67.28、119.67μM,毒性规律为Cr6+Cd~(2+)Cu~(2+)Pb~(2+)Zn~(2+)。与基于ERGO/GCE的单信号细胞电化学方法相比,该方法信号Ⅰ(鸟嘌呤/黄嘌呤)对重金属的毒性响应更为灵敏。与MWCNTs-IL/GCE相比,BCP/erGO/GCE的稳定性更高。4.制备了具有协同效应的聚罗丹明B/氧化石墨烯/碳纳米管修饰玻碳电极(PRhB/GO/MWCNTs/GCE),有效防止了GO纳米片和MWCNTs的团聚,提高了三维网状结构的电活性表面积和催化性能。研究了HepG2细胞裂解液的电化学行为,在+0.58V和+0.91 V位置检测到两个不可逆的氧化峰,结合高效液相色谱分析进一步证实其分别来源于鸟嘌呤/黄嘌呤、腺嘌呤/次黄嘌呤的氧化反应。利用该电极对HepG2细胞的生长曲线进行了跟踪,在此基础上建立了基于PRhB/GO/MWCNTs/GCE的双信号细胞电化学检测方法。研究了2,4,6-三氯酚(2,4,6-TCP)和五氯酚(PCP)对HepG2细胞的毒性,根据信号Ⅰ得到的IC50值分别为201.37μM和71.09μM,根据信号Ⅱ得到的IC50值分别为217.02μM和89.74μM,毒性大小顺序为PCP2,4,6-TCP。该电极也可用于对2,4,6-TCP和PCP含量的灵敏测定,检出限分别为0.8 nM和0.5 nM。据此,基于PRhB/GO/MWCNTs/GCE的电化学方法实现了对氯酚类污染物的定量检测与毒性评价。5.制备了可用于96微孔培养板的氧化石墨烯量子点/羧基化碳纳米管修饰铅芯微型电极(GOQDs/CMWCNTs/PGE),打破了常规电化学检测只能在培养皿中使用的局限,将细胞用量由1 mL降低为100μL。同时该复合修饰电极具有优异的导电性和催化活性,实现了对腺嘌呤和次黄嘌呤混合信号的分离,在+0.67 V、+0.94 V和+1.00 V位置检测到三个分别归属于鸟嘌呤/黄嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤的氧化峰。利用该电极研究了HepG2细胞的生长过程,进而建立了基于GOQDs/CMWCNTs/PGE的三信号细胞电化学方法。评价了Cd~(2+)、Hg~(2+)、Pb~(2+)、2,4-二硝基苯酚(2,4-DNP)、2,4,6-三氯酚(2,4,6-TCP)、五氯酚(PCP)六种环境优先控制污染物对HepG2细胞的毒性,基于信号I、信号II、信号III得到的IC50值分别为Cd~(2+):6.25、5.62、7.99μM;Hg~(2+):9.65、8.80、9.82μM;Pb~(2+):47.95、44.18、60.69μM;2,4-DNP:446.07、418.21、487.87μM;2,4,6-TCP:195.89、178.65、202.21μM;PCP:68.87、61.24、78.71μM,毒性顺序为Cd~(2+)Hg~(2+)Pb~(2+)PCP2,4,6-TCP2,4-DNP,与传统MTT比色法所得规律一致。基于GOQDs/CMWCNTs/PGE的细胞电化学方法具有成本低、灵敏度高等特点,为细胞生理代谢过程研究及环境污染物高通量分析提供了技术平台。
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本文编号：1981967