crgA调控三孢布拉霉合成类胡萝卜素作用分析

发布时间：2019-07-15 19:39

【摘要】：类胡萝卜素是一类具有多种生理功能的天然色素,具有极强的抗氧化能力,广泛应用于食品、保健品、医药等领域,市场需求量非常大。三孢布拉霉(Blakeslea trispora)生长迅速,类胡萝卜素含量高,是目前唯一已应用于工业化生产的微生物。但对该菌合成类胡萝卜素的调控机制尚缺乏认识,阻碍了类胡萝卜素合成水平的进一步提高。crgA是在卷枝毛霉(Mucor circinelloides)中发现的一个负调控基因,能够抑制类胡萝卜素的过量积累。三孢布拉霉与卷枝毛霉具有相近的系统分类地位,因此推测crgA在三孢布拉霉中可能存在类似的调控作用,本文基于上述假设进行了crgA调控三孢布拉霉合成类胡萝卜素的作用分析,以期为提高三孢布拉霉的类胡萝卜素合成水平奠定理论基础。本文以类胡萝卜素的主要合成者三孢布拉霉负菌为研究对象,首先克隆到了crgA基因,然后利用split-marker法对该基因进行敲除获得?crgA菌,并对?crgA菌进行基因回补。分析了三孢布拉霉野生菌、?crgA菌和C-?crgA菌产孢能力、类胡萝卜素结构基因转录水平、关键酶酶活、产物代谢水平的差异,以确定crgA对三孢布拉霉合成类胡萝卜素的调控作用。结果表明,敲除crgA后,三孢布拉霉的产孢能力显著下降,而将该基因重新导入到?crgA菌中,产孢能力恢复到野生型,表明crgA参与调控孢子的形成。本文分析了三种菌hmgR、carRA和car B在不同时间的转录水平。?crgA菌中hmgR、car RA和car B转录水平较野生菌分别最大提高了1.2、1.3和1.6倍,将crgA重新导入后,结构基因的转录则受到明显抑制。在酶活水平上,?crgA菌中HMG-CoA还原酶比活较野生菌最大提高了114.2%;三孢布拉霉菌丝体内和发酵液中抗氧化酶(Catalase,CAT;Superoxide dismutase,SOD;Peroxidase,POD)比活较大的提高。在类胡萝卜素合成水平方面,在发酵前36 h,番茄红素迅速积累,之后逐步转化为β-胡萝卜素,而?crgA菌的合成和转化速度明显高于野生菌。至发酵120 h时,?crgA菌中β-胡萝卜素含量达到46.39 mg?L~(-1),较野生菌提高了31.2%。在代谢水平上,采用GC-MS技术对三孢布拉霉野生菌和?crgA菌在不同培养时间的代谢物进行了分析,得到代谢物谱,并进行了聚类分析。结果表明野生菌和?crgA菌存在显著差异。?crgA菌代谢物中糖类物质和氨基酸含量明显低于野生菌,而类胡萝卜素、脂肪酸和醇类物质含量则明显高于野生菌。由上述结果可知,crgA是三孢布拉霉的一个负调控因子。基于多元统计模型中的主成分分析,筛选出了5个潜在的生物标记物:肌醇、棕榈酸、塔格糖、单硬脂酸甘油酯和苯,并以?crgA菌为出发菌株对肌醇进行了验证。向培养基中添加不同浓度的肌醇,生物量和β-胡萝卜素含量分别最大提高了18.3%和20.1%,表明肌醇在三孢布拉霉合成类胡萝卜素过程中起到积极的作用。此外,本文初步探究了光照对三孢布拉霉的调控作用,将野生菌和?crgA菌分别在光照和避光的条件下培养。在避光培养时,所有菌株不产生孢子,而β-胡萝卜素含量显著提高,表明光能够刺激孢子的生成但会抑制类胡萝卜素的合成。同时本文分析了乙酸钠对三孢布拉霉的影响,当乙酸钠浓度为2 g?L~(-1)时,β-胡萝卜素含量提高了20.0%。
文内图片： β-胡萝卜素分子结构

图片说明：类胡萝卜素是以异戊二烯为基本单位的多烯类化学物质，是一类广泛存在于动类及真菌中的天然色素。目前，已分离出的类胡萝卜素超过 600 种。类胡萝卜素两类，第一类是仅由碳和氢两种元素构成的胡萝卜素，其中最重要的代表是 β-胡（β-carotene）和番茄红素（Lycopene）；第二类是胡萝卜素的含氧衍生物。类胡是维生素 A 前体，，对人体健康有着十分重要的作用[1]。类胡萝卜素最显著的结构高度不饱和、含有 3-15 个共轭双键，共轭双键的存在使得类胡萝卜素具有较强化能力、能够消除人体内氧自由基[2]。因此，类胡萝卜素在防癌抗癌、预防心脑病及维持人体健康等方面有着广泛的应用[3]。目前研究最为广泛的是 β-胡萝卜素红素。.1 β-胡萝卜素理化性质β-胡萝卜素呈深红色，化学分子式为 C40H56，熔点为 184℃，其具有较强的极溶于水，可溶于石油醚、氯仿、甲醇等有机溶剂。β-胡萝卜素有四种顺反异构体为反式、9-顺式、13-顺式、15-顺式，其中反式可利用率最高[4]。β-胡萝卜素是维的前体，且作为氧化剂，被广泛应用于食品和药品工业[5]。β-胡萝卜素结构如图示。
文内图片：三孢布拉霉中甲羟戊酸途径Fig.1-3MevalonicacidpathwayinB.trispora

图片说明：图 1-3 三孢布拉霉中甲羟戊酸途径Fig.1-3 Mevalonic acid pathway in B. trispora拉霉中类胡萝卜素结构基因的研究途径中，hmgR、ipi、carG、carRA、carB 等是类胡萝卜素结素的合成，其中研究比较多的为 hmgR、carRA 和 carB。还原酶是类胡萝卜素合成的调控位点，提高 HMG-COA 还水平可以增加类胡萝卜素前体 HMG-COA 的含量，从而提高carRA 是一个融合基因，其编码的蛋白有 A 和 R 两个活性中肽链上。其中 A 具有八氢番茄红素合成酶的活性，而 R 具目前，在利用三孢布拉霉生产番茄红素时，一般采用向培养制剂的方法以阻断番茄红素的环化，但由于抑制剂普遍具有的方法抑制环化酶的活性而又不影响八氢番茄红素合成酶难题。carB 编码的八氢番茄红素脱氢酶也是关键酶之一，能茄红素中。carRA 和 carB 的表达受多种因素的影响，研究性激素[25]等能够显著提高 carRA 和 carB 的表达水平进而提高
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：O629.4;TQ920.1

【参考文献】