对具有对映体选择性捕获能力的α-螺旋短肽自组装的研究

发布时间：2019-07-17 06:22

【摘要】：由短肽自组装成的纳米结构对生物学、医学和生物技术都有极大的应用,因为这种具有自组装结构的模型肽的设计被证明是一个模拟蛋白质生物活性的理想靶点。理想的短肽组装结构的设计不仅仅是由氨基酸的序列决定的,短肽二级结构也是其中非常重要的一环。这样的短肽组装结构包括由环肽组成的管状结构、控制序列的短肽自组装成的纳米纤维结构、线性嵌段共肽自组装成的囊泡结构、循环分块的短肽自组装成的纳米环状结构和模拟胶原的短肽自组装成的纳米膜状结构。然而由短肽自组装成的纳米结构大多是以β-折叠为短肽的基本构象,因为相比较而β-折叠言,当把无规的短肽折叠成α-螺旋构象时,使短肽能过稳定折叠的相互作用和相邻螺旋圈之间的酰胺形成的氢键所产生的焓不能弥补短肽链的折叠时所损失的大量的熵。而α肽链自组装成所需的纳米结构的前提条件是短肽能过折叠形成稳定的α-螺旋构象。现在我们可知的在水中实现稳定的a-螺旋构象的方法有通过形成共价键的形式链接氨基酸侧链和金属螯合物等一些方法,除此之外环形短肽也被证明是一个形成稳定a-螺旋构象的有效方法。我们已经证明,使一个线性短肽头尾链接形成环状结构可以强制改变其二级结构从无规线团转变为a-螺旋。这种a-螺旋肽通过一维的小胶束的堆积而自组装成波状的纳米纤维。我们也在以前的文章中证明通过对β-折叠的短肽聚集体成环也可以形成α-螺旋构象。然而,大部分α肽都很难实现在无规线团和α-螺旋之间的动态构象转换,因为稳定的α-螺旋构象通常是通过共价键或者与动态运动不相容的非共价键“缝合”实现的。而这种无规线团和α-螺旋之间的动态构象转换对实现“可切换的肽纳米结构”是必不可少的。因此,如何实现α-螺旋结构和无规线团结构之间的动态转换成为了“可切换肽的纳米结构”的一个挑战。考虑到蛋白质的结构转变来源于肽链的构象变化,α-螺旋短肽的设计将预计将成为动态纳米结构构件的理想目标。本文包括三章,前两章的内容是已发表工作,发表在j.am.chem.soc.2016上,第三章的工作是目前正在研究中的工作,其特点是对“对映体选择性”的研究,分别讨论了无规线团和α-螺旋之间的可逆转变和在水中基于α-螺旋短肽的自组装所进行的对映体选择性分离。首先,在本文的第一章中,着重描述了如何实现短肽在水中的无规线团和α螺旋之间的可逆转换。我们认为,如果在短肽链上横向修饰聚醚树枝状小分子,通过聚醚链的热脱水现象可以实现无规线团结和α-螺旋之间的可逆转换,然后由折叠成α-螺旋的短肽自组装成肽纳米结构。其原理是由聚醚侧链的热脱水现象,可以增加聚醚侧链和肽链骨架之间疏水作用以期尽量减少水对α-螺旋短肽链内氢键的影响从而强制诱导无规的肽链“接受”α-螺旋构象。这里我们对三个短肽(1,2,3)进行了研究,其中短肽1由具有较高螺旋倾向的氨基酸序列kkk(faka)3fkkk组成,短肽2和短肽3则在短肽1的氨基酸序列的基础上通过点击化学在赖氨酸的边基上修饰具有热响应特征的聚醚树枝状分子。短肽1的cd(圆二色谱)显示,未经任何修饰的短肽1在不同的温度下都展现为无规线团的二级结构,只有当我们加入α-螺旋稳定剂(三氟乙醇)时,短肽1才能在水中折叠成稳定的α-螺旋构象。然而有趣的是,当我们把温度提升到一个确定的值时,修饰在短肽2和短肽3侧链上的具有热响应特征的聚醚树枝状分子可以诱导肽链从无规线团转变为α-螺旋。在室温条件下,短肽2(侧链上修饰了两个聚醚树枝状分子)的cd显示大约在196nm处有一个很强的负峰,表明短肽2主要的二级结构为无规线团结构。然而当加热温度到50度时,196nm处的负峰会红移到大约208nm处,同时在222nm处出现一个新的负峰,这表示短肽2已经从无规线团转变为α-螺旋。相似的情况同样发生在短肽3(侧链上修饰了三个聚醚树枝状分子)上。室温下,短肽3的cd在196nm处有一个强的负峰,表明此时短肽3的二级结构主要是无规线团。然而当我们升高温度时,短肽3的cd分别在206nm和222nm处有负峰,这表明此时短肽3已经折叠成α-螺旋构象。值得注意的是短肽3在222nm处产生的负峰强度要强于短肽2,这表明当升高温度时,短肽3比短肽2拥有更高的α-螺旋构象比。这个结果表明短肽2和短肽3都可以在升高温度时形成从无规线团到α-螺旋的转变。我们认为这种现象的产生正是由于修饰在肽链侧链上的聚醚树枝状分子的热脱水现象造成的。因为我们发现短肽2和短肽3都是在升高温度到45摄氏度时发生从无规线团到α-螺旋的剧烈转变,而聚醚链的最低临界温度正是45摄氏度,当高于这个温度时聚醚链的松散构象会因为脱水而“崩溃”从而诱导短肽折叠成α-螺旋构象。我们可以通过“短肽-水”之间的相互作用来理解为什么升高温度可以得到稳定的α-螺旋构象。升高温度后聚醚链的松散构型会因为脱水而“崩溃”,此时的聚醚侧链会从一个两亲性的基团转变成一个完全疏水的基团。这个疏水的基团会和肽链上的疏水的侧链(如丙氨酸和苯丙氨酸)产生强烈的相互作用从而减少肽链上可亲水的表面面积。与此同时聚醚链上的氧原子也会和带电荷的赖氨酸产生强烈的相互作用。这些来自聚醚树枝状分子的相互作用可以在“短肽-水”之间的相互作用时提供屏蔽效应,减少水对短肽链内氢键的影响,从而可以在升温后构建稳定的α-螺旋构象。在拥有高体积分数的聚醚链的短肽3的cd信号中222nm位置的负峰的强度要大于短肽2,这进一步证明了聚醚树枝状分子越多则构建稳定的α-螺旋构象就越有效。这和聚醚链在“短肽-水”之间的屏蔽效应是一致的。至此,我们成功的通过对温度的调节实现了短肽在水中的二级结构的可逆转变。这个可逆转变将会成为α-短肽自组装成“可切换的肽纳米结构”的关键。在本文第二章中,我们着重对α-短肽的形貌和应用进行了研究。首先经过对α-短肽形貌的研究我们发现,虽然短肽2和短肽3的氨基酸序列是相同的,但当我们调节温度到45摄氏度时,短肽2和短肽3会自组装成不同的两种纳米结构。其中短肽2自组装成圆盘状结构,而短肽3则自组装成囊泡结构。对于短肽2,我们的设想是横向修饰聚醚树枝状分子的棒状α-螺旋短肽会彼此平行排列从而自组装成二维的圆盘状的平面纳米结构。为了进一步观察短肽2的自组装纳米结构,我们采用透射电子显微镜(tem)对短肽2进行了实验。在室温条件下,在透射电子显微镜中我们没有观察到任何明显的聚集,同时动态光散射(dls)实验也证明了这一点,这说明在室温条件下,短肽2在水中以分子溶解的状态存在。然而,当我们升高温度时,短肽2的透射电子显微镜图像显示为平均粒径为80nm的圆盘状纳米结构。值得注意的是,圆盘的边缘处有定向的折叠现象,这意味着由热诱导形成的螺旋短肽在圆盘结构中是平行排列的。同时这种圆盘状的纳米结构也在冷冻透射电镜(cryo-tem)图像中出现,这进一步证明了这种圆盘状纳米结构在水中的存在。关于短肽2的圆盘状结构原子力显微镜(afm)提供了更多的结构信息,原子力显微镜图像显示,由短肽2组装成的圆盘状纳米结构的厚度为3.2nm,这个厚度和我们的设想的单层膜结构的尺寸是相吻合的。这说明这种圆盘状结构是由螺旋的短肽2平行排列成的单层膜结构。不同于短肽2形成的圆盘状纳米结构,侧链上修饰了三个聚醚树枝状分子的短肽3会自组装成弯曲的囊泡状结构。透射电子显微镜(tem),扫描电子显微镜(sem)和动态光散射(dls)实验都证明了囊泡状结构的存在。当升高温度至50摄氏度,短肽3形成α-螺旋结构后,透射电子显微镜(tem)图像显示短肽3自组装成了一个直径约60nm至120nm大小的球状物体。经冷冻透射电子显微镜(cryo-tem)图像确认,这个具有外圆的球状聚集体是一个空心的囊泡,囊泡壁的厚度为3.2nm。动态光散射(dls)实验数据表明,这种聚集体的直径大概是90nm,这和透射电子显微镜的观察是吻合的。这种在高温下形成的囊泡纳米结构被进一步的用扫面电子显微镜(sem)证实,在扫描电子显微镜中我们也观察到球状的聚集体,聚集体尺寸和透射电子显微镜中观察到的囊泡状结构的尺寸相似,这作为额外的证据表明囊泡状结构在水中的存在。为了理解这种空心球状结构的形成方式,我们对高度稀释的短肽3水溶液进行了研究。短肽3的稀释液的透射电子显微镜(tem)图像显示短肽3自组装成了宽度为3.8nm的短链纳米纤维结构,这表明囊泡壁是由这些短链纤维组成的。考虑到短肽螺旋的计算长度为3.5nm,那么这些短链纤维是由短肽横向排列组成的。当我们升高浓度时,这种基本的纳米纤维体通过并排的相互作用产生平坦的膜结构。这个结果说明短肽3自组装成的囊泡壁是由平面膜各自沿着纤维轴和螺旋轴两个垂直方向折叠形成的。考虑到α-螺旋含量较少的短肽2自组装成了圆盘状纳米结构,而α-螺旋含量较高的短肽3自组装成了囊泡状结构,这说明α-螺旋结构在短肽中的含量是在形成弯曲的囊泡状结构的关键。当我们得到这种由α-短肽自组装成的可切换的膜状结构后,关于这种膜结构的应用成为了我们下一步的研究方向。考虑到这种膜状结构是由棒状的α-螺旋短肽平行排列组成的,那么α-螺旋短肽之间因排列而留下的空隙将会是有手性的。由此我们设想,由α-短肽3组装成的囊泡可以作为一个对映体选择性的膜,通过使一种对映体比另一种对映体更快的穿过这种膜状结构的方式实现手性分离的目的。为了证明这种囊泡壁具有对映体选择性渗透的性质,我们在室温条件下在短肽3水溶液中加入了外消旋体1-(4-溴苯基)乙醇,然后升高温度到55摄氏度。由前文可知,当升高温度时,短肽3自组装成囊泡状结构,此时当囊泡状结构形成时会包裹一些外消旋体1-(4-溴苯基)乙醇在囊泡空心的内部。经葡聚糖凝胶柱(sephadexcolumn)过滤后,使被包裹的外消旋体和未被包裹的外消旋体分离,被包裹在囊泡内的外消旋体可以用高效液相色谱法(hplc)进行检测。囊泡内外消旋体的优先选择性释放的效果可以用高效液相色谱法进行跟踪检测。每隔一段时间,我们对经葡聚糖凝胶柱(sephadexcolumn)过滤后得到的溶液进行二次葡聚糖凝胶柱(sephadexcolumn)过滤,过滤得到的囊泡内的外消旋体的含量由高效液相色谱法进行检测,由此我们可以得到囊泡内外消旋体的浓度变化趋势,根据此趋势我们可以做出囊泡内外消旋体浓度随时间变化的趋势图。此趋势图显示,随着时间的变化,囊泡内两种对映体的浓度都呈下降的趋势,这说明随时间的延长,两种对映体都会逐渐的通过囊壁渗透出去。值得注意的是,(r)构型的对映体的渗透速度要快于(s)构型的对映体。经过三个小时的分离之后,囊壁对对应体的选择性分离达到最大效果,对应体过量(ee%)达到12%。这一结构表明,外消旋体可以在囊泡形成过程中被包裹在囊泡的空腔内,然后选择性的释放出来。从第一章和第二章的结果来看,这种横向将聚醚侧链修饰到肽骨架上的方法可以成功的使短肽在无规线团和α-螺旋两个二级结构中自由转变。短肽二级结构的转换功能是由于聚醚侧链可逆的屏蔽了肽链和水相环境之间的作用。此外,可逆的α-螺旋短肽自组装成可切换的膜结构,这种膜结构是由α-螺旋短肽相互平行排列的。基于两个聚醚侧链的短肽2自组装成圆盘状纳米结构,而修饰了三个聚醚侧链的短肽3自组装成囊泡状纳米结构。这里短肽自组装的主要驱动力是形成可逆的稳定α-螺旋结构。此外更主要的是,升高温度后由短肽3自组装成的空心囊泡可以在自组装的过程中自发的捕获外消旋体,然后选择性的优先释放一种对映体,达到手性分离的效果。考虑到大部分膜结构都很难做到和囊泡结构的动态转换,这种由短肽形成的膜有两个显著的特点,一是他们通过自组装捕获外消旋体的能力;二是这种膜可以选择性的释放对映体客体分子。我们相信这种独特的肽组装会给蛋白质、基因和药物的受控捕获和释放等生物医学应用提供一个新的领域。最后在第三章中介绍了一些我们目前的工作,目前我们的工作重心是这种由α-螺旋短肽自组装的膜状结构如何实现对对映体的高度选择性从而达到对对映体的百分之百的分离效果和如何应用这种高度选择性。从前两章的内容可知,α-螺旋短肽自组装的膜状结构可以实现对对映体的选择性分离,但是这种可逆转变的膜结构需要在高温的条件下才能实现手性分离效果,其次这种膜的分离效果不高。为了改进这种膜结构的选择功能性,我们在短肽1、2和3的基础上合成了短肽4。短肽4和短肽2、3的相似之处是两种短肽的氨基酸个数是一样的,而区别是短肽4的侧链上修饰的是两个芘化合物,我们期望在水中由于芘和芘之间强大的π-π共轭作用诱导短肽4在室温下形成稳定的α-螺旋构象,进而像短肽3一样组装成囊泡结构。短肽4在水中的cd显示在208nm和222nm处各有一个负峰,这表明在室温下短肽4在水中已经折叠成α-螺旋。而通过投射电子显微镜的观察我们同样发现了类似囊泡状的结构,同时冷冻投射电镜也表明这种类囊泡状结构同样是中空的。所以在由短肽4组装成的囊泡的基础上我们进行了对映体的选择性分离实验。我们选择了体积更大的二肽作为客体分子,通过相似的对映体选择性分离方法,我们进行了对映体选择性释放和对映体选择性捕捉(先组装成囊泡结构,然后加入对映体客体分子,随时间的变化其中一种对映体会比另一个对映体更先进入囊泡空腔中,从而达到手性分离的效果)。两个实验显示,对于对映体选择性释放实验,在大约三小时后会达到最大效果,对映体过量达到100%,我们会得到(l)构型的对映体。对于对映体选择性捕捉,大约在2小时至4小时间达到最大效果,对映体过量达到100%,我们会得到(d)构型的对映体。这说明通过对囊泡状结构的不同方法的应用我们可以使囊泡在对映体混合物中选择性的包裹单一手性分子。通过这些实验结果我们相信囊泡的选择性包裹这一特点可以在手性反应中得到很好的应用。为了验证在囊泡中做手性反应的可行性,我们进行进一步的实验。首先我们包裹一些带有三键官能团的没有手性的客体分子在囊泡中,然后在反应体系中加入带有叠氮官能团的对映体混合物和催化剂。每隔一段时间,我们反应溶液进行葡聚糖凝胶柱(sephadexcolumn)过滤,过滤得到的囊泡内的产物由高效液相色谱法进行检测。我们发现在三小时内,我们可以得到d-构型的产物,这说明在三小时内只有d-构型的带有叠氮官能团的小分子被选择性的进入囊泡内和无手性客体分子进行反应,从而得到d-构型的产物。从以上实验中我们证明了这种由α-短肽自组装成的囊泡状结构对对映体有高度选择性,我们可以通过不同的分离方法在囊泡内得到d或l构型的对映体,而且我们利用囊泡的选择性包裹这一特点,我们成功在囊泡中实现了手性反应,我们相信这种在肽组装内的反应会给手性应用提供一个新的领域。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：O629.72

【相似文献】