碳点基荧光纳米探针的构建及其在细胞成像和酶活性评价中的应用
发布时间：2019-07-22 18:30
【摘要】：随着生命科学的迅速发展,人们越发重视生命体系中的生物分子(核酸、蛋白质、酶、小分子等)的分析检测。人体中的生物分子如与细胞功能和遗传性状相关的蛋白质和核酸、与肿瘤和癌症相关的标志物分子、与人体正常生长发育相关生物小分子的出现和变化,预示着人体正常生理机能的失调和病变。因而,生命体系中的生物分子的分析检测对预防体系病变具有极其重要的意义。近几年,兼具独特的物理和化学性质的碳纳米材料如碳纳米管、石墨烯、碳纳米颗粒等激发了巨大的研究兴趣。因具有良好的光学性质、生物相容性等诸多优良性质,碳纳米材料在生命分析领域得到了广泛而有效地应用。碳点作为一种新型碳纳米材料,具有成本低、发射光谱可调、生物毒性低等诸多优势,构建基于碳点的荧光纳米探针用于生命分析,逐渐成为分析化学研究的热点。然而,碳点基荧光纳米探针的构建通常需对碳点表面进行修饰或功能化,这一过程繁琐耗时。并且,目前仅有少部分碳点基荧光纳米探针用于生物大分子的检测。本论文基于利用碳点与目标分析物之间的相互作用实现目标分析物的检测的目的。重点利用乌头酸基碳点与叶酸之间的相互作用发展了叶酸检测和靶向癌细胞成像的荧光纳米探针;并基于银离子调控碳点荧光构建了一种纳米探针,用于谷胱甘肽还原酶活性评价和抑制剂筛选。全文分为四章:第一章:简单总结了碳纳米材料的分类及其在生物分析方面的应用,进一步简述了碳点的分类、制备方法、理化性质及其在分析化学方面的应用,着重阐述了碳点在生物分析方面的应用。第二章:以乌头酸(aconitic acid,AA)和乙二胺为前驱体,通过水热法制备了一种蓝色荧光碳点(AA-CDs)。AA-CDs具有良好的水溶性和优异的光学性能,可与叶酸(folic acid,FA)发生相互作用使其荧光淬灭,基于此建立了FA的定量分析方法,检测限为40 nM,并成功应用于叶酸药片、燕麦、牛奶、果汁中FA含量的检测。通过FA和AA-CDs之间的静电吸引作用构建了一种弱荧光纳米探针FA-AA-CDs,将其用于叶酸受体(folate receptor,FR)表达程度不同的Hela细胞、SMMC-7721细胞和A549细胞的荧光成像,结果显示,细胞荧光亮度与FR表达程度一致,表明该探针可实现靶向癌细胞成像。第三章:以1,2,4-三氨基苯为前驱体,通过溶剂热反应制备了一种黄色荧光碳点。Ag+离子能够通过电子转移淬灭该碳点的荧光,而谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)通过NADPH辅助催化还原氧化型谷胱甘肽(glutathione oxide,GSSG)生成还原型谷胱甘肽(glutathione reduced,GSH),GSH能够竞争结合Ag+离子,使碳点表面的Ag+离子释放出来,进而恢复其荧光。基于上述原理,我们构建了一种用于GR活性评价的荧光纳米探针,GR检测限为0.1 mU mL-1。并将其用于监测GR抑制剂1,3-二(2-氯乙基)-1亚硝基脲(BCNU)对GR活性的抑制。第四章:在第三章工作基础上,构建了一种谷胱甘肽还原酶抑制剂筛选体系。抑制剂对GR预处理使其失去活性后,GR无法催化还原GSSG生成GSH使碳点荧光恢复,根据体系荧光能否恢复可实现对GR抑制剂的筛选。本工作以已报道的五种抑制剂作为参照,考察了五种含亚硝基、羰基、硫代羰基的化合物对GR活性的影响,实现了GR抑制剂的筛选。
【图文】：
兰州大学硕士研究生学位论文 碳点基荧光纳米探针的构建及其在细胞成像和酶活性评价中的应用酸之间的共轭作用，构建了叶酸功能化的荧光纳米探针，将其用于靶向癌细胞成像[39-42]。然而，碳点的钝化过程繁琐耗时，并且钝化剂会影响叶酸与叶酸受体之间的结合，进而影响靶向成像。本章工作中，我们以乌头酸(aconitic acid, AA)为前驱体，以乙二胺作为共掺杂剂，通过简单的水热反应制备了一种蓝色荧光碳点(AA-CDs)，将 AA-CDs 的绝对量子产率进一步提高至 56.5%。并且，未经表面钝化或修饰的 AA-CDs 能够与 FA 发生相互作用，使 AA-CDs 的荧光发生淬灭。基于此，我们发展了一种灵敏检测 FA 的方法。此外，我们由 FA 共轭的 AA-CDs 得到了一种弱荧光探针(FA-AA-CDs)，并以 Hela、SMMC-7721 和 A549 三种叶酸受体表达程度不同的细胞作为模型，考察了 FA-AA-CDs 用于荧光恢复靶向癌细胞成像的可行性。
兰州大学硕士研究生学位论文 碳点基荧光纳米探针的构建及其在细胞成像和酶活性评价中的应用条件下的培养箱中进行培养。首先将在培养瓶中培养 48 h 后的细胞稀释，并接种在放置细胞爬片的 12 孔板上(1 mL/well)，，培养 24 h 后加入 50 μL AA-CDs 或FA-AA-CDs 溶液。此外，加入过量叶 FA 孵育 2 h 后再加入 FA-AA-CDs 溶液孵育 2 h 的 Hela 细胞作为对照实验考察 FA-AA-CDs 进入细胞的方式。细胞中加入材料孵育一定时间后，用 PBS 缓冲溶液(10 mM, pH 7.4)洗涤三次，并将培养细胞的爬片固定在载玻片上，用奥林巴斯荧光显微镜采集细胞成像结果。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q2-33;O657.3
【图文】：
兰州大学硕士研究生学位论文 碳点基荧光纳米探针的构建及其在细胞成像和酶活性评价中的应用酸之间的共轭作用，构建了叶酸功能化的荧光纳米探针，将其用于靶向癌细胞成像[39-42]。然而，碳点的钝化过程繁琐耗时，并且钝化剂会影响叶酸与叶酸受体之间的结合，进而影响靶向成像。本章工作中，我们以乌头酸(aconitic acid, AA)为前驱体，以乙二胺作为共掺杂剂，通过简单的水热反应制备了一种蓝色荧光碳点(AA-CDs)，将 AA-CDs 的绝对量子产率进一步提高至 56.5%。并且，未经表面钝化或修饰的 AA-CDs 能够与 FA 发生相互作用，使 AA-CDs 的荧光发生淬灭。基于此，我们发展了一种灵敏检测 FA 的方法。此外，我们由 FA 共轭的 AA-CDs 得到了一种弱荧光探针(FA-AA-CDs)，并以 Hela、SMMC-7721 和 A549 三种叶酸受体表达程度不同的细胞作为模型，考察了 FA-AA-CDs 用于荧光恢复靶向癌细胞成像的可行性。
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【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q2-33;O657.3
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本文编号：2517810
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