MALDI-TOF质谱准内标法及其用于rhTPO复杂糖一致性研究

发布时间：2019-09-29 04:48

【摘要】：采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)准内标法准确测定重组人血小板生成素(rhTPO)仿制药和原研药中4类糖修饰的相对含量,并进行样本间和批间一致性比较。结合多种切糖酶逐步切除rhTPO的N-糖、唾液酸和O-糖;以牛血清白蛋白(BSA)为标准品,与样本非混合点靶;采用MALDI-TOF质谱准内标法检测,分别获得各样本完整含糖分子量及不同层次切糖后分子量;通过分子量差值计算4类糖修饰的相对含量;最后比较仿制药与原研药样本间和批间一致性。以BSA多电荷峰对rhTPO切糖前后的MALDI-TOF质谱测定值进行准内标法校正,BSA多电荷峰之间相对标准偏差(RSD)均≤0.075%,批间RSD为0.001%~0.004%,方法误差均0.01%。rhTPO仿制药N-糖、O-糖唾液酸、O-糖和糖化糖的相对含量分别约为24.6%、2.9%、9.0%和5.1%,批间一致性良好,且总糖含量与文献值一致;rhTPO原研药N-糖、O-糖唾液酸、O-糖和糖化糖的相对含量分别约为25.6%、2.9%、7.9%和3.5%,总糖含量较文献值偏低。与rhTPO原研药相比,仿制药糖基化糖相对含量基本一致,糖化糖含量有差异。rhTPO糖化糖研究未见文献报道,其差异是不同厂家rhTPO之间差异的重要因素,主要由发酵工艺差异导致。
【图文】：

示意图,内标法,示意图,唾液酸

1460分析测试学报第36卷图1MALDI－TOF质谱内标法(上)和准内标法(下)示意图Fig.1Schematicdiagramofinternal(top)andquasi-internal(bottom)calibrationofMALDI－TOFMSa，b:correctionvalue;c:correctedvalue1实验部分1.1材料与仪器rhTPO仿制药(批号:A1，A2，A3)为国内药企生产;rhTPO原研药(批号:B)为特比澳制剂(国产)抽提物，由rhTPO仿制药公司提供。N-糖切除酶PNGase－F、唾液酸切除酶Neuraminidase均购自Sigma公司;O-糖切除酶(O-Glycosidase)购自NEB公司;牛血清白蛋白(BSA)购自Ｒoche公司;α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)购自Fluka公司。4800型MALDITOF/TOF质谱购自AB公司。1.2仪器参数MALDI－TOF质谱线型正离子检测模式检测，加速电压为18.2kV;离子源电压为20kV;N2激光器，波长337nm，能量6000;延迟提取时间(PIE)480ns，质谱信号单次扫描累加2000次，，质量扫描范围m/z5000～80000。数据分析软件为DE4.5(ABSciex)。1.3实验方法取rhTPO仿制药和原研药各150μg(1mg/mL，约150μL)，加入8mol/L尿素至尿素终浓度为6mol/L，4℃变性30min后超滤去除尿素，以50mmol/L碳酸氢铵置换溶剂，按酶与蛋白的质量比为1∶25加入N-糖切除酶，涡旋混匀后37℃孵育16h切除N-糖，取20μL于－20℃保存备用;剩余样本以50mmol/L磷酸钠溶液(pH6.0)超滤置换溶剂，按酶与蛋白的质量比为1∶100加入唾液酸切除酶，涡旋混匀后37℃孵育12h去除唾液酸，取20μL置于－20℃保存备用;剩余样品以50mmol/L磷酸钠溶液(pH7.5)超滤置换溶剂，按酶体积与蛋白质量的比例为1∶10加入O-糖切除酶，涡旋混匀后37℃孵育6h切除O-糖，样本于－20℃保存备用。各取未切糖、切N-糖、切O-糖唾液酸、切O-糖的各样本和BSA标准品适量，分别与基质(CHCA)按适当比例混匀，按准内标法点靶，用MALDI－TOF质?

含糖分,内标法,电荷,方法误差

本首先进行MALDI－TOF质谱检测获得完整含糖分子量，以BSA多电荷峰(单电荷、二电荷及三电荷)进行准内标法校正，以A1为例，其校正质谱图见图2，准内标法校正结果见表1。BSA多电荷峰之间相对标准偏差(ＲSD)≤0.019%，批间ＲSD为0.002%，与序列分子量的误差(即方法误差)小于0.006%。准内标法校正后测得仿制药(A1、A2、A3)的完整含糖分子量在57550～57930Da之间，3批间的ＲSD为0.37%，批间一致性良好(表2)。与文献［4］的完整含糖分子量(57539Da)相比，rhTPO仿制药与文献值基本一致，rhTPO原研药含糖分子量(56302.6Da)则明显偏低。图2rhTPO完整分子的MALDI－TOF质谱图Fig.2MALDI－TOFMSofintactrhTPOA:rhTPO(A1)afterBSAinternalcalibration;B:rhTPO(A1)afterBSAquasi-internalcalibration表1rhTPO切糖前后样本BSA准内标法的校正结果比较Table1ComparisonofBSAquasi-internalcalibrationresultsofrhTPObeforeandafterglycanremovedBatchIntactglycoproteinN-GlycanremovedSialicacidoftheO-glycanremovedO-GlycanremovedAvg.M.W．(Da)ＲSD(%)Error(%)Avg.M.W．(Da)ＲSD(%)Error(%)Avg.M.W．(Da)ＲSD(%)Error(%)Avg.M.W．(Da)ＲSD(%)Error(%)A166432.210.0140.003366430.060.0010.000166429.180.0220.001266431.340.0110.002A266430.790.0060.001266430.040.0040.000166428.900.0210.001766428.570.0090.002A366431.350.0030.000566429.940.0010.000166429.050.0400.001466436.190.0480.009B66433.890.0190.005866431.920.0750.002966426.200.0510.005766427.900.0190.003Avg.(Da)66432.0666430.4966428.3366429.97ＲSD(%)0.0020.0010.0020.004*Avg.andＲSDwereusedtoevaluatetheconsistencyof3batchesbios
【作者单位】：安徽医科大学研究生院;军事医学科学院放射与辐射医学研究所;蛋白质药物国家工程研究中心蛋白质组学国家重点实验室北京正旦国际科技有限责任公司;
【基金】：国家高技术研究发展计划863项目(2014AA020906) 国家科技部重大仪器专项(2012YQ18011710) 蛋白质组学国家重点实验室课题(SKLP-O201412)
【分类号】：O657.63;R927.2

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