超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用检测红色糖多孢菌胞内中间代谢物同位素丰度

发布时间：2019-09-28 21:56

【摘要】：采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪(LC-MS/MS),建立了能精确检测红色糖多孢菌胞内代谢物~(13)C同位素丰度的方法。在优化的超高效液相色谱的条件及三重四极杆串联质谱的离子传输电压和碰撞池电压下,筛选出各胞内代谢物的最佳离子对。根据物质在LC-MS/MS中生成的母离子和子离子碳链长短及子离子是否含有~(13)C等特性,建立了"一对一"法、"一对多"法和单级质谱SIM法等同位素丰度检测方法。利用这些方法,检测了自然标记标准品和~(13)C标记实验样品,根据实验值与理论值的接近程度筛选出最优方法。结果表明,对于以磷酸糖类为代表的子离子不含有~(13)C的代谢物,"一对一"法最有效;对于以有机酸类为代表的母离子和子离子都含有~(13)C的短碳链代谢物,"一对多"法更有优势;对于以辅酶A类为代表的母离子和子离子都含有~(13)C且碳链较长的代谢物,单级质谱SIM法才能发挥作用。建立的同位素丰度检测方法具有较好的准确度,可应用于红色糖多孢菌胞内代谢物同位素丰度的检测,为后续研究菌体的代谢机理,实现红霉素的高效表达奠定了基础。
【图文】：

原理图,“一对一”,原理,母离子

图1“一对一”法的原理。黑色圆代表碳原子带13C标记，白色圆代表碳原子不带13C标记Fig．1Principleofone-to-onemethod．Blackcirclesmeancarbonatomswith13Clabel，whitecirclesmeancar-bonatomswithout13Clabel2．5．2“一对多”法“一对多”法的原理如图2，同样以带4个碳原子的母离子碰撞形成带2个碳原子的子离子为例，当母离子为M+2时，子离子可能是m+0、m+1、m+2，子离子的设定值为三者的中间值，降低Q3的分辨率，也就是增大Q3检测的半高峰宽(FWHM)，扩大了Q3的检测范围，将3种情况一次性检测出来。检测带4个碳原子的母离子需要的离子对有5个，等于母离子碳原子数加1，较“一对一”法有大幅度的减少。“一对多”法的设置如附录2，扫描模式为SＲM，负离子模式。由于MAL的母离子与子离子所含的碳原子数一样，故母离子与子离子所带的标记信息一致，MAL不存在“一对多”法。2．5．3单级质谱SIM方法单级质谱SIM方法的设置如附录3，FWHM设为0．3amu。2．6同位素丰度检测方法的验证用Isopro软件来计算胞内代谢物自然标记同位素丰度理论值，然后用建好的方法，进样标准品，得到实测值，将理论值与实测值对比，差距用残差平方和(SSＲ)表示。在进行标记实验时，底物中标记的葡萄糖经过菌体代谢，会将13C转移到胞内代谢物的碳骨架上，图2“一对多”法的原理，黑色圆代表碳原子带13C标记，白色圆代表碳原子不带13C标记。Fig．2Principleofmany-to-onemethod．Blackcirclesmeancarbonatomswith13Clabel，whitecirclesmeancarbonatomswithout13Clabel．当同位素稳态时，胞内代谢物的FL值固定，将理论的FL值与实测的FL值对比，对方法进行评估。FL=∑ni=0i·Min·∑ni=0Mi

碳原子,“一对多”,黑色,白色

图1“一对一”法的原理。黑色圆代表碳原子带13C标记，白色圆代表碳原子不带13C标记Fig．1Principleofone-to-onemethod．Blackcirclesmeancarbonatomswith13Clabel，whitecirclesmeancar-bonatomswithout13Clabel2．5．2“一对多”法“一对多”法的原理如图2，同样以带4个碳原子的母离子碰撞形成带2个碳原子的子离子为例，当母离子为M+2时，子离子可能是m+0、m+1、m+2，子离子的设定值为三者的中间值，降低Q3的分辨率，也就是增大Q3检测的半高峰宽(FWHM)，扩大了Q3的检测范围，将3种情况一次性检测出来。检测带4个碳原子的母离子需要的离子对有5个，等于母离子碳原子数加1，较“一对一”法有大幅度的减少。“一对多”法的设置如附录2，扫描模式为SＲM，负离子模式。由于MAL的母离子与子离子所含的碳原子数一样，故母离子与子离子所带的标记信息一致，MAL不存在“一对多”法。2．5．3单级质谱SIM方法单级质谱SIM方法的设置如附录3，FWHM设为0．3amu。2．6同位素丰度检测方法的验证用Isopro软件来计算胞内代谢物自然标记同位素丰度理论值，然后用建好的方法，进样标准品，得到实测值，将理论值与实测值对比，差距用残差平方和(SSＲ)表示。在进行标记实验时，，底物中标记的葡萄糖经过菌体代谢，会将13C转移到胞内代谢物的碳骨架上，图2“一对多”法的原理，黑色圆代表碳原子带13C标记，白色圆代表碳原子不带13C标记。Fig．2Principleofmany-to-onemethod．Blackcirclesmeancarbonatomswith13Clabel，whitecirclesmeancarbonatomswithout13Clabel．当同位素稳态时，胞内代谢物的FL值固定，将理论的FL值与实测的FL值对比，对方法进行评估。FL=∑ni=0i·Min·∑ni=0Mi
【作者单位】：华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室;
【基金】：国家自然科学基金(No.21276081) 国家科技支撑项目(No.2011BAF02B05)资助~~
【分类号】：O657.63;TQ927

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