基于新型量子点荧光微球的氯霉素免疫层析试纸条的制备和应用

发布时间：2019-11-13 19:14

【摘要】：以羧基化CdTe/ZnSe量子点荧光微球为标记物,通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)活化法将氯霉素(CAP)单克隆抗体与量子点荧光微球偶联制备荧光探针。氯霉素全抗原(CAP-HS-BSA)及羊抗鼠二抗分别喷涂硝酸纤维素膜,形成检测线(T线)和质控线(C线),组装成新型氯霉素量子点荧光微球免疫层析试纸条,建立了快速、定量检测牛奶中CAP的方法。本研究开发的量子点荧光微球试纸条可在15min内完成牛奶样品中CAP的定量检测,线性范围为0.1~100.0μg/L,检出限为0.1μg/L。牛奶样品CAP的加标回收率为93.3%~97.9%,相对标准偏差在4.9%~6.9%之间。
【图文】：

图1QBs荧光试纸条检测氯霉素的原理图。(A)试纸条组装结构图;(B)试纸条结果示意图Fig．1Schematicillustrationofquantumdotsubmicrobeads(QBs)-basedimmunochromatographicteststrip(ICST)forchloramphenicol(CAP)detection:(A)structureofQBs-basedICTS;(B)schematicdiagramofCAPdetectionbyQBs-basedICTS2．6实际牛奶样品分析通过在阴性牛奶中的加标回收实验，评价QBs荧光试纸条的准确性以及精密度，加标浓度为0．1和10μg/L。为了进一步评价开发的QBs荧光试纸条的实用性，研究分析了30份加标牛奶样品(10份牛奶加标浓度为0．1μg/L，10份牛奶加标浓度为10μg/L，其余10份为阴性对照)，并将实验结果与商品化ELISA试剂盒的检测结果进行对比。3结果与分析3．1半抗原CAP-HS和全抗原CAP-HS-BSA的鉴定采用HPLC分析半抗原CAP-HS的合成效果。结果表明，CAP色谱峰保留时间为8．0min(图2A)，CAP-HS的保留时间为9．5min(图2B)。BSA(500μg/mL)、CAP-HS-BSA(500μg/mL)及CAP-HS(50μg/mL)在220～340nm范围内的紫外光谱图如图2C所示，CAP-HS-BSA和BSA在280nm左右均有一个吸收峰，但是相同蛋白浓度的CAP-HS-BSA在280nm的吸光值是BSA吸光值的数倍，这是由于BSA与CAP-HS偶联后吸光值叠加的缘故，因此可以初步判定CAP-HS与BSA偶联成功。SDS-PAGE凝胶电泳分析(图2D)也显示，CAP-HS-BSA的电泳条带滞后于蛋白标准品BSA，说明全抗原CAP-HS-BSA合成成功。3．2QBs荧光探针制备条件的优化本研究通过将适量的QBs荧光探针溶液滴加在试纸条的结合垫上(试纸条的NC膜只包被有C线)，根据C线的荧光情况选出制备QBs荧光探针的最佳条件。当pH7．5时，C线上QBs探针-二抗偶联物的荧光强度最强，随着pH值升高，C线荧光强度下降(见?

图2氯霉素半抗原CAP-HS及全抗原CAP-HS-BSA鉴定。(A)CAP标准品的高效液相色谱图;(B)CAP-HS高效液相色谱图;(C)CAP-HS-BSA，CAP-HS以及BSA的紫外光谱图;(D)CAP-HS-BSA与BSA的SDS-PAGE电泳图Fig．2IdentificationofCAP-HSandCAP-HS-BSA．(A)HPLCanalysisofCAP;(B)HPLCanalysisofCAP-HS;(C)UVspectraofCAP-HS-BSA，CAP-HSandBSA;(D)SDS-PAGEelectrophoretogramofCAP-HS-BSAandBSA．HS，succinicanhydride;BSA，bovineserumalbumin;SDS-PAGE，sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis使用2倍稀释的QBs探针组装的试纸条(喷涂量2μL/cm)检测含有CAP的样品时，获得的T/C值明显高于3倍稀释的QBs探针，因此本研究最终选择2倍稀释的QBs探针包被试纸条的结合垫(见图4C)。免疫层析试纸条的显色是抗原抗体免疫学动态反应过程，为了优化反应时间，本研究考察了试纸条检测1μg/LCAP浓度时T/C值随时间的变化，加入待测样品后，通过成像系统每隔5min记录试纸条T线和C线荧光强度(图4D，插图为不同免疫反应时间下的S/N值)。结果表明，在30min内，空白对照组和阳性组的T/C值变化不明显，在15min时，S/N值(相同时间点下对照组和阳性组的T/C值的比值)达到最大，随着时间延长，S/N值逐渐降低，，NC膜上的非特异性结合增强使背景颜色加深，故选择15min为试纸条的最佳分析时间。3．3．2T线抗原及C线二抗喷涂浓度的优化由表1可知，固定C线喷涂的二抗含量，试纸条T线的荧光强度随T线上抗原的浓度增加而加强，T/C值也随着抗原浓度的加大而增加;当固定T线上抗原的量为0．6mg/mL时，试纸条C线的荧光强度随着二抗浓度的加大而增强。第4、5和8、9组中，虽然T线和C线的荧光强度随着抗原或二抗的浓度增加而增加，但抑制率偏低;第6组中，包被的二抗浓度为0．2mg/mL时，?

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