基于酶辅助信号放大和DNA自组装纳米结构的生物标志物传感研究

发布时间：2020-03-22 10:48

【摘要】：生物分子(核酸、蛋白质、酶、细胞、组织和生物小分子等)的简单、快速及高效灵敏检测在疾病诊断、食品药品分析、环境监测和科学研究等方面具有十分重要的意义。随着社会发展的需要,完善和发展操作更加简单、灵敏度更高、特异性更强以及检测通量更高的生物传感技术已成为生物分析领域的一个研究热点。本论文首先立足简化实验操作步骤、提高检测灵敏度和特异性地需求,借助等温酶辅助信号放大技术和DNA催化自组装信号放大技术发展了新颖的可视化及荧光生物传感体系并应用于核酸和蛋白质分子的灵敏检测。并通过对实际样品(血清及细胞裂解液)中生物分子的分析检测,验证了这些方法的可行性、可靠性及适用性。为了进一步深入研究单细胞内多个RNA目标物地表达及空间分布信息,本研究采用DNA四面体纳米结构及原位滚环扩增技术(RCA)分别对单细胞内两种重要RNA的分布及表达情况进行了同时荧光成像分析,并对其相应的检测机理及检测性能做了深入研究和探索。这些研究方法在检测灵敏度、选择性、适用性以及检测通量等方面都取得了良好的实验结果。具体的研究工作归纳为以下几个部分:1.二次循环信号放大策略免标记灵敏可视化检测HIV DNA近年来,可视化检测越来越受到广大研究者地关注和青睐,因为可视化检测方法无需使用任何特殊先进仪器即可实现目标生物分子的快速检测。然而,使用可视化方法实现痕量生物分子的检测并达到与PCR方法相媲美的检测灵敏度仍然面临着巨大的挑战。本研究基于核酸外切酶III(Exo III)辅助的DNA循环和功能化DNA酶(辣根过氧化物模拟酶),发展了一种新型的二次循环信号放大策略用于目标物HIV DNA的灵敏可视化检测。当有目标物HIV DNA存在时,在Exo III的辅助下可引发两个独立且同时进行的DNA循环过程。该二次循环信号放大过程使得G-四倍体序列锁定的两个DNA发卡型探针被识别催化水解并最终释放出大量自由的G-四倍体序列,这些G-四倍体序列可以和Hemin结合生成G-四倍体/Hemin辣根过氧化物模拟酶并催化溶液由无色转变为绿色,通过溶液颜色地改变实现对目标物HIV DNA低至2.5 pmol L~(-1)的灵敏可视化检测。该可视化检测方法采用未修饰DNA发卡型探针,避免了任何复杂和昂贵信号转导仪器地使用,因此在本质上非常简单和经济。此外,该可视化检测方法也展现出良好的单碱基错配识别能力。通过合理的探针设计,该方法可被拓展应用于其它DNA生物标志物的灵敏可视化检测。2.目标物引发二次循环信号放大策略免标记灵敏可视化检测细胞因子基于脱氧核糖核酸酶(DNAzyme)探针的可视化生物检测方法由于其简单的检测机理近年来引起广大研究者们的浓厚兴趣。然而,要进一步提升该可视化检测方法的灵敏度并将其应用范围拓展到其它非核酸目标物的检测仍然面临着两个重大挑战。在本研究体系中,我们巧妙设计了一个DNA发卡型适配体DNA酶探针并基于该发卡型探针发展了一个新的二次循环信号放大策略应用于细胞因子的灵敏可视化检测。当出现目标物细胞因子(干扰素γ,IFN-γ)时,目标物IFN-γ可与DNA发卡型探针的适配体序列特异性结合并将其打开,此时溶液中已经存在的Bst-聚合酶和λ核酸外切酶可以协助实现目标物IFN-γ和一段DNA中间目标物的同时循环并达到二次循环信号放大的效果。经过该二次循环放大过程溶液中产生了大量的G四倍体序列,并可结合氯化血红素(Hemin)生成大量G-四倍体/Hemin辣根过氧化物模拟酶(DNA酶),该模拟酶可催化无色的ABTS~(2-)变为加深的绿色并以此实现对目标物IFN-γ的可视化高灵敏检测,裸眼检测限可以低至50 pmol L~(-1)。再者,该可视化检测方法对目标物IFN-γ具有高度的选择性,在均相溶液中使用未修饰的适配体DNA酶探针即可实现目标物的可视化检测。鉴于该方法所具备的独特优点,我们通过对检测探针的合理再设计即可开发新的检测平台并实现对其它生物分子地检测。3.RNA诱导催化自组装DNA纳米结构实现癌细胞中miRNA的高灵敏检测近年来,微小RNA(miRNA)被作为一种新型的肿瘤标志物应用于癌症的早期检测及相关研究。由于miRNA序列较短、家族同源序列相似度高、表达含量低和易降解等本质特征,使得miRNA的高特异性准确定量分析变得复杂。在本研究中,以癌细胞中特异性表达的miRNA-21为引发剂,借助等温足点介导的链置换反应催化DNA发卡型探针级联组装形成“烟花状”DNA纳米结构并以此实现miRNA-21的荧光灵敏检测。由于DNA纳米结构自组装过程中引发剂miRNA-21被循环再利用,因此少量的目标物miRNA-21可诱导催化自组装形成大量的DNA纳米结构并实现荧光检测信号的放大。本研究采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了DNA纳米结构的自组装过程及自组装时间对DNA纳米结构构型的影响。miRNA-21引发DNA纳米结构自组装技术作为一种新型的信号放大策略实现了目标物miRNA-21的超灵敏荧光检测。实现了人乳腺癌细胞(MCF-7)中miRNA-21的荧光灵敏检测,并可检测到低至10个癌细胞。因此,本研究工作为DNA纳米结构在各种癌症早期诊断中的应用提供了技术支持和新的机会。4.多色荧光编码可变构DNA纳米结构实现活细胞内多个miRNAs的同时检测近年来,金纳米颗粒和石墨烯被广泛应用于生物体内的分析研究,但在实际操作中这些纳米材料往往需要复杂的制备过程和繁琐的功能化步骤。同时这些无机材料自身的生物毒性使其在生物体内的实际应用方面一直存在着很大地争议。在本研究工作中,我们利用DNA良好的生物相容性、无毒性和可控性等方面的显著优势,构建了一个可重构、多色荧光编码DNA四面体纳米结构并将其应用于活细胞内多个miRNAs的同时分析检测。DNA四面体纳米结构探针是由四条单链寡核苷酸(ssDNA)通过简单的一步退火制得,其中两条ssDNA包含两个荧光淬灭的发卡型结构。当有目标miRNA存在时,两个发卡型结构被所对应的miRNA特异性杂交打开并恢复不同的荧光信号从而实现对miRNA的多重检测。更为重要的是,和普通的DNA分子信标相比较,DNA四面体纳米结构探针在细胞裂解物中具有良好的稳定性,可高效稳定地进入细胞并实现细胞内两种不同miRNA的同时检测。自组装DNA四面体纳米结构对细胞内miRNA的成功传感分析为其在成像、药物递送和体内癌症治疗中地深入应用提供了有利的技术支持和潜能。5.可编程DNA环/发卡纳米结构应用于单细胞中多重mRNA的高灵敏成像近年来大量研究证明mRNA地表达与癌症的发生、发展及转移具有十分密切的关系,且mRNA被作为一种新型的肿瘤标志物应用于癌症的早期诊断和机理探讨。因此,单个癌细胞内多种mRNA的同时原位检测和成像对于癌症早期检测具有重要意义。本研究构建了一个可编程DNA环/发卡纳米结构,以细胞内特异性表达的两种重要mRNA为引发剂启动滚环扩增反应,并通过不同荧光信号分子的识别杂交实现单个癌细胞中TK1和Survivin mRNA的同时原位荧光检测,且检测分辨率接近单分子水平。与传统的RCA成像方法相比较,本研究提出的原位RCA检测方法操作步骤简单,成功避免了复杂的目标mRNA反转录过程以及挂锁DNA探针的连接过程。同时,通过使用荧光淬灭的dsDNA信号探针显着降低背景噪声并使用发卡识别探针增强了检测的选择性。该研究方法利用原位滚环扩增信号放大和多重荧光检测性能的优势,实现了癌细胞内两种低表达mRNA的原位放大检测并有效抑制了假阳性信号的产生,为早期癌症诊断提供了更加准确和完整的参考信息。
【图文】：

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图 1.1 生物传感器原理图Fig.1.1 Schematic diagram of biosensor1.3 信号放大技术在实际的生物检测分析中，尤其是在疾病临床早期诊断、食品药品监测、环

策略原理

图 1.2 核酸外切酶Ⅲ辅助的目标物循环放大策略原理图[7]。g. 1.2 Schematic illustration of exonuclease III aided target recycling strategy. Copyri2010ACS.
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O657.3

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