L-苯甘氨酸生物催化合成体系的构建及固定化研究

发布时间：2020-03-31 03:27

【摘要】：L-苯甘氨酸是一种手性非天然氨基酸,作为一种重要的原料化合物和药物中间体,可用于合成青霉素,维及霉素,普那霉素I等β-内酰胺类抗生素,也可用于抗肿瘤药物紫衫醇的合成,在医药领域具有广阔的市场前景。L-苯甘氨酸主要通过化学法合成,但化学合成反应条件剧烈、工艺复杂、副产物较多、产品光学纯度较低,需要进一步光学拆分;且合成过程中需要用到大量的有机溶剂和有毒物质,工业污染严重。因此,本研究围绕L-苯甘氨酸的生物合成开展了以下几方面的工作:L-苯甘氨酸催化合成体系的构建及工艺优化;分子支架介导的多酶自组装及磁性固定化;胞内酶的比例及辅酶水平的优化以及全细胞磁性固定化,取得的主要研究结果如下:(1)利用Bacillus cereus来源的亮氨酸脱氢酶(BcLeuDH)和Candida boidinii来源的甲酸脱氢酶(CbFDH)构建了L-苯甘氨酸的多酶催化合成体系,并对转化条件进行了优化。结果表明,该转化体系可有效地用于L-苯甘氨酸的合成,最适转化条件为:底物苯乙酮酸60 g/L,辅底物甲酸铵50.4 g/L,Bc LeuDH 4 U/mL,CbFDH 2 U/mL,NAD~+浓度为0.14 g/L,pH 8.0,30℃。在最优条件下,1 L的转化体系中,转化反应5 h,苯乙酮酸转化率达到99%,L-苯甘氨酸产量60.2g/L,ee值99(4)。(2)利用小蛋白CipB为分子支架制备了同时具有Bc LeuDH和CbFDH活性的两酶共聚集体,并对其进行磁性固定化,用于L-苯甘氨酸的多批次转化合成。将存在于Photorhabdus luminescens中的两种小蛋白CipA和CipB分别与BcLeuDH和CbFDH进行融合表达,并对小蛋白的种类,连接短肽的类型以及酶的融合方式进行了优化,最终得到表达量和酶活最优的融合酶AIB-L和AIB-F,分别保留了野生酶68.8(4)和52.2(4)的酶活,并大部分以酶聚集体的形式存在,且融合酶稳定性得以提高。进一步构建融合酶AIB-L和AIB-F的共表达菌株,以CipB为分子支架,实现融合酶AIB-L和AIB-F的胞内共聚集,得到活性酶共酶聚集体AIB-M,并检测了AIB-M的酶活及转化合成L-苯甘氨酸的能力,结果表明,AIB-M的转化速率比同等酶活的游离酶提高了50(4),最后,利用磁性纳米Fe_3O_4对AIB-M进行的磁性固定化,并将固定化AIB-M用于连续多批次转化合成L-苯甘氨酸,最终,经过13个批次的转化,L-苯甘氨酸的产量达到97.5 g/L,比单批粗酶液转化产量提高了62.5(4)。(3)通过调节共表达体系中BcLeuDH和CbFDH_(A10C)的表达比例来提高全细胞转化合成L-苯甘氨酸的效率。将重组菌株中CbFDH_(A10C)基因的拷贝数从1增加到4个,当CbFDH_(A10C)的拷贝数为3时,重组菌CbFDH_(A10C)的酶活为0.45U/mL,比单拷贝菌株中酶活提高了87.5(4)。进一步通过不同强度的RBS来调节共表达菌株中BcLeuDH的表达,得到重组菌CHL-1,其胞内Bc LeuDH与CbFDH_(A10C)的比值接近最佳比例2:1,Bc LeuDH和CbFDH_(A10C)的酶活分别为1.45U/mL和0.65 U/mL,全细胞催化活性提高了3.3倍。利用菌株CHL-1作为全细胞催化剂,在细胞添加量为10 g/L DCW、pH 8.0、30℃、及甲酸铵:苯乙酮酸为2∶1条件下,转化持续5 h之后,L-苯甘氨酸的产量达到60 g/L,转化率达到100(4),ee(29)99(4)。(4)胞内辅酶水平对辅酶依赖型的催化体系具有重要影响。通过在菌株CHL-1中共表达NAD~+补偿合成途径的关键酶烟酸转磷酸核糖激酶(NAPRTase)和NAD~+合酶(NAD~+Syn)得到菌株CHL-2,使得胞内辅酶水平提高了2.35倍,全细胞催化活性提高了56.2(4)。随后,在培养基中添加20 mg/L的烟酸(NA),菌株CHL-2胞内辅酶水平进一步提高2.42倍,最终在胞内关键酶过表达和培养基添加NA的共同作用下,菌株CHL-2中胞内辅酶水平提高了9.24倍,其全细胞催化活性提高了1.4倍,全细胞生产效率提高了70.4(4)。在1 L转化体系中利用菌株CHL-2作为全细胞催化剂,在相同的条件下,仅用4 h,L-苯甘氨酸的产量达到60 g/L,转化率达到100(4),进一步提高了全细胞转化效率。(5)通过对大肠杆菌细胞的磁性固定化实现L-苯甘氨酸全细胞转化体系中细胞的快速分离和回收利用。制备的磁性纳米材料的表征结果显示:Fe_3O_4和Fe_3O_4@PEI粒子均具有标准的立方结构相晶型,粒径在50-200 nm之间,Fe_3O_4@PEI表面PEI包覆的平均厚度约为2 nm,Fe_3O_4@PEI的表面电荷明显高于Fe_3O_4,Fe_3O_4的等电点在pH 6左右,而经PEI修饰的磁性纳米粒子的等电点上升至pH 10左右,说明PEI成功包覆于Fe_3O_4表面。通过对纳米材料Fe_3O_4@PEI制备及吸附条件的优化,Fe_3O_4@PEI的细胞载量达4.5 g DCW/g。利用壳聚糖包裹磁性细胞复合物的最佳浓度为0.1 g/L,SEM显示壳聚糖成功地包覆在磁性细胞复合物表面,最终形成的固定化细胞具有超顺磁性可以通过磁场实现快速分离,固定化细胞的稳定性得到提高。最终,将固定化细胞应用于L-苯甘氨酸转化合成,在1 L体系中,经过7个批次的转化,L-苯甘氨酸的产量达到105.5 g/L,得率达到21.1 g/g DCW,分别比游离细胞单批转化提高了75.8(4)和2.5倍,通过细胞的磁性固定化显著提高了L-苯甘氨酸全细胞转化效率。
【图文】：

1.2 L-苯甘氨酸的合成方法1.2.1 L-苯甘氨酸的化学合成苯甘氨酸的化学合成研究起源于上世纪60年代的氰化钠法，如图1-2所示，主要生产厂家有日本的化学株式会社以及荷兰的 DSM 公司。80 年代后，我国陆续有厂家开始生产 L-苯甘氨酸，目前多数采用工艺成熟，合成路线简单的氰化钠法进行生产。但氰化钠法需要用到大量剧毒氰化钠，，对参与合成过程的工作人员的身体健康有一定的危害，且生产形成的污水处理困难，容易造成水土污染；另外，合成产物为对映体混合物，需要进一步进行手性拆分获得 L-苯甘氨酸，增加了生产成本。为避免氰化物的使用

江南大学博士论文酸，在有机酯环叔胺或活泼卤化物的催化下，用液氨或者浓氨水氨苯甘氨酸，进一步拆分得到光学纯苯甘氨酸[3]。该方法提升了产物率，但此生产工艺操作步骤比较繁琐，反应条件严格等问题。图 1-2 氰化钠法合成路线Fig. 1-2 Synthesis of phenylglycine from sodium cyanide
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O643.36;O625.636

【参考文献】

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本文编号：2608489