组合酶合成GDP-岩藻糖
发布时间：2020-04-09 19:39
【摘要】：GDP-岩藻糖,即二磷酸鸟苷岩藻糖,是一种核苷酸糖,作为糖基供体和代谢中间体广泛存在于各类生物中。在真核生物体内,它主要作为蛋白质糖基化的重要糖基供体和合成其他糖核苷酸的前体,为岩藻糖基化反应中提供岩藻糖基,是生命代谢调节过程中不可或缺的重要物质;在工业生产中,GDP-岩藻糖作为合成人乳寡糖的重要中间产物,在人乳寡糖的合成中具有重要的作用,拥有广阔的市场发展前景。因此,合成GDP-岩藻糖具有重要理论意义和实际应用价值。本论文的主要研究结果如下:1.本研究从大肠杆菌K-12基因组中克隆得到GDP-岩藻糖合成相关酶基因manB,从大肠杆菌BL-21(DE3)基因组中克隆得到GDP-岩藻糖合成相关酶基因manC、gmd、fcl,分别将基因与pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-6P-1、pGEX-6P-1载体连接,将重组质粒转化至大肠杆菌BL-21(DE3)中获得重组菌株。重组菌株在25~oC下0.1 mM IPTG诱导24 h,可实现重组蛋白的可溶性表达。破碎后的粗酶液经过GST-Sefinose Resin亲和层析纯化,得到纯度较高的GDP-岩藻糖合成相关重组酶。质谱检测酶转化底物结果显示,manB-pGEX-4T-1不能将底物转化为产物,其余3种蛋白纯化效率较低,分别为1.0%,1.6%,5.17%,因此,需要高效表达并纯化GDP-岩藻糖合成相关重组蛋白。2.成功构建manB-pET-28a-BL21(DE3)、manC-pET-28a-BL21(DE3)、gmd-pET-28a-BL21(DE3)和fcl-pET-28a-BL21(DE3)重组工程菌株。mpglk-pET-28a-BL21(DE3)由苏州弘讯生物科技有限公司全序列合成,经过IPTG诱导后均实现了蛋白的可溶性表达。对GDP-岩藻糖合成相关酶的产量从载体、培养基、IPTG诱导浓度和诱导时间4个方面进行了优化。通过对TB培养基和LB培养基的对比,选择TB培养基为重组菌株的生长提供营养成分。通过对IPTG诱导浓度和诱导时间优化,分别得到了最佳的蛋白表达条件,mpglk为0.02 mM、48 h,manB为0.08 mM、48 h,manC为0.04 mM、36 h,gmd为0 mM、36 h,fcl为0.08 mM、36 h。最终优化后5种GDP-岩藻糖合成相关酶的产量分别是未优化的1.58、2.27、3.31、3.80和3.79倍。3.对GDP-岩藻糖合成过程中间产物甘露糖-6-磷酸的合成进行了优化,确定了合成甘露糖-6-磷酸的最佳反应条件:5 mM甘露糖,10 mM六偏磷酸钠,5 mM MgCl_2,0.5mg/mL mpglk,100μL PBS缓冲体系,37~oC反应8 h。甘露糖-6-磷酸的产率达到80%。简化了第三步中间产物GDP-甘露糖的合成步骤,即同时在反应体系中加入底物甘露糖和mpglk、manB、manC,37~oC反应12 h,可生成GDP-甘露糖;比较并优化了三种GDP-岩藻糖的合成路线,得到产率最高的合成路径。即同时在反应体系中加入底物甘露糖、磷酸供体GTP、mpglk、manB和manC,反应12 h,加入gmd 37~oC反应2 h,最后加入fcl 37~oC反应2 h,GDP-岩藻糖达到最高转化率1.50%。
【图文】：
在细胞质中合成，但 CMP-唾液酸除外，它是先在细胞核中合成，之后转运到细胞质中。核苷酸糖是核苷二磷酸或核苷一磷酸与不同单糖异头碳羟基形成的衍生物[21]，是糖类合成或相互转换时的活化形式，核苷酸糖在二糖和多糖合成过程中起非常重要的作用如图 1-1（a）所示，为核苷酸糖的结构通式，以及两种常用的化学合成核苷酸糖的方法[22]。合成核苷酸糖最重要的是连接糖和核苷之间的磷酸键，最常用的是使用糖-1-磷酸（糖-1-P）和活化的核苷单磷酸（NMP）进行焦磷酸化（1-1（a），途径 b），也可通过使用带有糖基供体的核苷二磷酸（NDP）直接糖基化来制备（1-1（a），途径 a）。在动物细胞中[23]，最常见的核苷酸糖类型为含尿苷或鸟苷的核苷二磷酸（UDP 或 GDP）与一些糖相连，包括戊醛糖，如尿苷二磷酸-木糖（UDP-Xyl）；己醛糖，如尿苷二磷酸葡萄糖，尿苷二磷酸-半乳糖（UDP-Glc，UDP-Gal）；己醛糖胺，如尿苷二磷酸- N-乙酰葡糖胺，尿苷二磷酸- N-乙酰半乳糖胺（UDP-GlcNAc，UDP-GalNAc）和糖醛酸如尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA）组分。这些在常见哺乳动物中常见的核苷酸糖例子如图 1-1（b）左侧所示[24]。在细菌中[25]也发现了的一些核苷酸糖，例如鸟苷二磷酸-甘露糖（GDP-ManA），尿苷二磷酸-呋喃半乳糖（UDP-Galf）和鸟苷二磷酸-D-鼠李糖（GDP-D-Rha）。
图 1- 1（b） 哺乳动物和细菌体内核苷酸糖动物细胞中的糖基化主要由三种组分构成[26]：糖残基的受体，供体和位于粗面内质网表面和高尔基体不同区域中的高特异性糖基转移酶。糖残基的受体可以是蛋白质，脂质或其他简单和复杂的糖。核苷二磷酸糖（NDP）可以充当糖残基的供体[27]。NDP 可以含有腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）或尿嘧啶（U）作为含氮碱基。共含有有超过 50 种不同的 NDP。 NDP 主要在细胞质中核苷三磷酸和 1磷酸糖相互作用时产生。在动物组织中，每个单糖只对应于某一种核苷二磷酸，更严格地对应于其杂环碱基[28]。因此，对于 L-岩藻糖而言，GDP-岩藻糖为唯一的供体；L-鼠李糖则对应 TDP-鼠李糖；而葡萄糖的供体是 UDP-葡萄糖。相反，植物和细菌含有多个核苷二磷酸的供体。例如，葡萄糖可以与 UDP（二磷酸尿苷），，GDP（二磷酸鸟苷），ADP（二磷酸腺苷）和 CDP（二磷酸胞苷）结合。植物细胞含有一组负责产生不同的葡萄糖结合核苷酸的酶[29]，这些核苷二磷酸在更复杂的碳水化合物的生物合成期间作为葡萄糖残基的供体。NDP 不仅具有比产物更大的自由能，还拥有特异性糖基转移酶可识别的个体构象[30]。因此可以作为糖残基的供体参与到糖基化的过程中。
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78;O629.1
本文编号：2621182
【图文】：
在细胞质中合成，但 CMP-唾液酸除外，它是先在细胞核中合成，之后转运到细胞质中。核苷酸糖是核苷二磷酸或核苷一磷酸与不同单糖异头碳羟基形成的衍生物[21]，是糖类合成或相互转换时的活化形式，核苷酸糖在二糖和多糖合成过程中起非常重要的作用如图 1-1（a）所示，为核苷酸糖的结构通式，以及两种常用的化学合成核苷酸糖的方法[22]。合成核苷酸糖最重要的是连接糖和核苷之间的磷酸键，最常用的是使用糖-1-磷酸（糖-1-P）和活化的核苷单磷酸（NMP）进行焦磷酸化（1-1（a），途径 b），也可通过使用带有糖基供体的核苷二磷酸（NDP）直接糖基化来制备（1-1（a），途径 a）。在动物细胞中[23]，最常见的核苷酸糖类型为含尿苷或鸟苷的核苷二磷酸（UDP 或 GDP）与一些糖相连，包括戊醛糖，如尿苷二磷酸-木糖（UDP-Xyl）；己醛糖，如尿苷二磷酸葡萄糖，尿苷二磷酸-半乳糖（UDP-Glc，UDP-Gal）；己醛糖胺，如尿苷二磷酸- N-乙酰葡糖胺，尿苷二磷酸- N-乙酰半乳糖胺（UDP-GlcNAc，UDP-GalNAc）和糖醛酸如尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA）组分。这些在常见哺乳动物中常见的核苷酸糖例子如图 1-1（b）左侧所示[24]。在细菌中[25]也发现了的一些核苷酸糖，例如鸟苷二磷酸-甘露糖（GDP-ManA），尿苷二磷酸-呋喃半乳糖（UDP-Galf）和鸟苷二磷酸-D-鼠李糖（GDP-D-Rha）。
图 1- 1（b） 哺乳动物和细菌体内核苷酸糖动物细胞中的糖基化主要由三种组分构成[26]：糖残基的受体，供体和位于粗面内质网表面和高尔基体不同区域中的高特异性糖基转移酶。糖残基的受体可以是蛋白质，脂质或其他简单和复杂的糖。核苷二磷酸糖（NDP）可以充当糖残基的供体[27]。NDP 可以含有腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）或尿嘧啶（U）作为含氮碱基。共含有有超过 50 种不同的 NDP。 NDP 主要在细胞质中核苷三磷酸和 1磷酸糖相互作用时产生。在动物组织中，每个单糖只对应于某一种核苷二磷酸，更严格地对应于其杂环碱基[28]。因此，对于 L-岩藻糖而言，GDP-岩藻糖为唯一的供体；L-鼠李糖则对应 TDP-鼠李糖；而葡萄糖的供体是 UDP-葡萄糖。相反，植物和细菌含有多个核苷二磷酸的供体。例如，葡萄糖可以与 UDP（二磷酸尿苷），，GDP（二磷酸鸟苷），ADP（二磷酸腺苷）和 CDP（二磷酸胞苷）结合。植物细胞含有一组负责产生不同的葡萄糖结合核苷酸的酶[29]，这些核苷二磷酸在更复杂的碳水化合物的生物合成期间作为葡萄糖残基的供体。NDP 不仅具有比产物更大的自由能，还拥有特异性糖基转移酶可识别的个体构象[30]。因此可以作为糖残基的供体参与到糖基化的过程中。
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78;O629.1
【参考文献】
相关硕士学位论文 前1条
1 喻小春;酶法合成甘露糖-6-磷酸[D];北京化工大学;2016年
本文编号：2621182
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/huaxue/2621182.html
教材专著
