环介导等温扩增及生物分析新方法研究

发布时间：2020-05-09 04:45

【摘要】：近些年来,生物技术的快速发展极大的推动了生命科学和分析化学学科的发展。其中核酸放大技术作为分子生物学中的一项重要技术,因具有较高的灵敏度和较快的反应速率,备受研究者的青睐,被广泛应用于生物分析、临床诊断等领域。但是,实现目标物的实时、快速、灵敏检测仍然是科研工作者追求的目标。本论文基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,建立了几种新型的LAMP方法用于microRNA、尿嘧啶-DNA糖基化酶活性、单核苷酸多态性以及致病菌基因的检测。本论文建立的方法具有操作简单、反应快速、灵敏度高以及特异性好等优点。具体内容如下:MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约为22个核苷酸的单链RNA,在基因调控方面发挥着重要的作用,发展一种准确、高效的miRNA检测方法具有重要的意义。在第2章中,构建了一种基于连接的环介导等温扩增(Ligation-LAMP)方法用于miRNA的高灵敏检测。首先,将目标miRNA反转录成其互补DNA序列cDNA;然后,在连接酶的辅助作用下,以cDNA为模板连接两条发夹探针,产生一个双哑铃结构的DNA分子;双哑铃结构DNA作为LAMP循环反应的引发物引发放大反应,最终产生大量的长度不一的茎-环结构DNA,利用SYBR Green I对产物进行染色,产生荧光增强信号。通过测定反应的实时荧光强度曲线,达到检测目标miRNA的目的。与传统的LAMP方法相比,该方法的独特之处在于将高保真的Taq DNA连接酶引入LAMP反应用于产生双哑铃结构DNA,进而引发LAMP循环扩增。Taq DNA连接酶的引入使得本方法具有很好的单碱基错配识别能力。此外,该方法可以实现从1 fM到1 nM浓度范围内miRNA的定量检测,检测下限为0.2 fM,可以用于复杂样品中miRNA的检测。尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)参与DNA的碱基切除修复过程,是一种重要的DNA糖基化酶,在保持基因完整方面发挥着至关重要的作用。在第3章中,基于茎-环引物介导的指数放大(SPEA)反应发展了一种无需标记的高灵敏方法用于UDG的活性检测。首先,UDG剪切掉辅助发夹探针HP上的尿嘧啶碱基产生一个脱碱基位点。这个脱碱基位点可以被溶液中存在的核酸内切酶IV切割,释放出一条单链DNA序列。这条单链DNA序列进而引发与另外两条发夹探针H1和H2之间的链置换反应,产生一个双哑铃结构的DNA分子,进而引发LAMP反应的循环放大步骤,产生大量的茎-环结构DNA产物。利用双链特异性染料SYBR Green I对DNA产物进行染色,产生荧光信号。通过监测反应的实时荧光曲线,实现对UDG活性的分析测定。本方法采用SYBR Green I作为信号分子,无需荧光基团标记,检测成本较低,可以实现1 mU/mL到1 U/mL浓度范围内UDG的活性检测,检测下限低至0.68 mU/mL,并且在实际体系中具有良好的检测性能。另外,本方法还可以用于UDG抑制剂的测定。单核苷酸多态性(SNPs)是人类可遗传变异中最常见的一种,占所有已知多态性的90%以上,发生在基因编码区的SNP与许多疾病有关,因此SNP的检测对临床诊断和疾病治疗具有十分重要的意义。在第4章中,将具有单碱基识别能力的RNase H2酶引入到环介导等温扩增方法中,发展了一种简单、高效的引物激活LAMP(PA-LAMP)方法用于SNP的特异性检测。设计一条单碱基错配识别探针BIP,在靠近其3’端修饰一个和突变目标互补的RNA碱基,并且在3’末端修饰一个C3 spacer以防止聚合酶的延伸。当突变目标存在时,BIP和目标DNA在RNA碱基位置完全互补,RNase H2酶切断RNA碱基上游的磷酸二酯键,产生一个带有羟基的3’末端,激活BIP作为引物引发LAMP反应的放大步骤。在此放大反应中,由于BIP需要被RNase H2酶切割才能被聚合延伸,所以SNP可以被反复识别,这大大提高了本方法的选择性。该方法可以达到近10000倍的错配区分率,可以检测到浓度低至22 aM的突变目标,并且能够用于实际基因组样品中SNP的检测。第5章中,建立了一种基于PA-LAMP方法的艰难梭菌和嗜肺军团菌双重检测策略。首先针对两种目标的致病基因序列分别设计一套高效的引物,在靠近FIP的3’端修饰一个RNA碱基,作为RNase H2酶的识别位点。然后在此RNA碱基的两侧分别标记一个荧光团和一个淬灭团,其中艰难梭菌和嗜肺军团菌的FIP分别标记不同荧光团。当与其引物对应的目标序列存在时,RNase H2酶就会循环切割并激活含有RNA碱基的FIP引物引发LAMP反应,荧光恢复产生相对应的荧光基团的荧光信号,通过测定这两种荧光信号的实时荧光曲线,实现对两种致病菌的同时检测。该方法不仅具有较好的灵敏度和特异性,并且可以用于细菌基因组提取样品中艰难梭菌和嗜肺军团菌的同时检测,为LAMP方法的进一步发展应用奠定了基础。
【图文】：

LAMP反应的原理示意图

增加两条环引物的LAMP反应的原理示意图
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O657.3;Q503

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本文编号：2655611