空间分辨微纳色谱分析技术

发布时间：2020-05-22 10:08

【摘要】：组织样品中的蛋白质鉴定一直是生物学研究领域的一项具有挑战性的课题。基于LC-MS/MS平台的经典蛋白质组学虽然可以实现蛋白质的深度覆盖,从而提供全面的数据信息,但在样品制备过程中往往丢失了蛋白质分子的空间信息。近年来,蛋白质组学对于组织样品的空间分辨分析提出了更高的要求。虽然质谱成像技术解决了空间分辨分析的问题,但由于质谱技术的限制,理解质谱数据背后的生物学意义依旧十分困难。因此,目前迫切需要一种空间分辨的蛋白质组学分析方法。在本论文中,我们分别建立了聚丙烯酰胺晶胶原位酶解和L-赖氨酸硅胶棒固定化酶探针两种原位酶解方法,实现了空间分辨的蛋白质组学分析。全文包含以下几个部分:论文的第一章主要阐述了目前蛋白质组学研究中面临的问题和挑战,对经典蛋白质工作流中的样品制备方法进行了综述,并对现有的空间分辨蛋白质组学分析技术进行了总结。提出了本论文的研究目的在于实现空间分辨的蛋白质组学分析,并对蛋白质进行更深度的覆盖。论文的第二章中,我们利用聚丙烯酰胺晶胶原位酶解技术,将样品酶解和采样结合在一起,实现了空间分辨的蛋白质组学采样和分析。实验表明,管内聚合方式制备的聚丙烯酰胺晶胶尺寸更精准且容易操作。6%的聚丙烯酰胺晶胶孔径更大,具有更高的传质效率和负载量,在原位酶解蛋白质时表现更优。聚丙烯酰胺晶胶原位酶解采样技术的最小采样尺寸可达92 m,鉴定蛋白质数为450。成功实现了对大鼠皮质层和纹状体的空间分辨蛋白质组学分析。论文的第三章中,我们利用L-赖氨酸硅胶棒固定化酶探针进行了空间分辨蛋白质组学分析的尝试。我们利用L-赖氨酸作为单体化合物,3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)和四甲氧基硅烷(TMOS)共同作为溶胶-凝胶反应前体,制备了杂化硅胶整体材料,采用交联剂戊二醛在整体材料上共价键合胰蛋白酶,获得杂化硅胶整体固定化酶反应器。实验表明这种固定化酶反应器通透性较好,交联度较高,机械强度较高。固定化酶反应器酶解标准蛋白牛血清白蛋白时得到的序列覆盖度高达94.4%,这显示出它对复杂样品的分析有巨大的潜质。这部分工作中,我们成功利用液滴微流控技术制备了 L-赖氨酸硅胶棒,并将其固定到毛细管中,制备了 L-赖氨酸硅胶棒固定化酶探针,但由于硅胶棒孔径较小、采样接触面积较小、且存在较大的采样位阻,无法实现很好的原位酶解采样。论文的第四章总结了本论文的研究工作,对不足之处进行了探讨,并对为了进一步的研究工作进行了展望。
【图文】：

蛋白质组学,样品制备,步骤

0逡逑常见的蛋Ａ质组学样品制备步骤分为：样品采集、样品匀浆化、蛋内质提取、逡逑蛋白质酶解，如图１．２所示。逡逑样品采集逡逑细胞逡逑—逦样品匀浆化逦蛋白质提取逦蛋白质酶解逡逑Ｉ邋—备一巧逡逑体液逦罾逡逑Ｖ逦Ｊ逡逑图１．２常见的蛋白质组学样品制备步骤逡逑１．２．１样品采集逡逑常见的蛋白质组学样品分为体液、细胞、微生物和组织，样品采集一般是粗逡逑放式大质量的直接采样。体液是最容易采集的样品，通常直接从生物体中抽取，逡逑如血液、脑脊液和唾液等的采集方法；细胞或微生物则需要进行有目的的培养，逡逑在进行样品处理前需要将细胞或微生物与培养基分离；而组织则根据Ｉ〗的的不同，逡逑有些实验需要对整个器官或部分组织进行采集，而有些临床上的病理学检查则只逡逑需要进行少量组织穿刺。对于经典蛋白质组学分析来说，由于蛋白质的复杂性和逡逑多样性，采集的样品量不能过少，否则后续分析鉴定将面临

气相色谱,固相微萃取,采样装置,活体

ＡＶ？＂邋Ｖｔ＊．逦、－逡逑第一章前目体采样是一个比较特殊的领域，ＳＰＭＥ因其独特的采样方式及在此领域得以应用。面向活体的ＳＰＭＥ装置一般设计为类似样器（顶空进样）或是金属的针状探针［６５］（用于直接采样），如是将具有吸附涂层的萃取纤维暴露在样品中直接进行萃取。经后，将ＳＰＭＥ探针直接放到气相色谱热脱附或使用溶剂解吸进行分析。随着近些年检测仪器分析灵敏度的极大提高，上述分钟甚至几秒钟迅速完成。逡逑
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O657.3

【相似文献】