【摘要】：化学性肝损伤是由化学肝毒性物质所造成的肝损伤,能进一步发展为肝硬化甚至肝癌,严重威胁着人类健康。目前市场上已有许多保肝药物,但是价格昂贵且毒副作用较大,在临床使用上受到极大限制。因此,开发具有良好的保肝效果且毒副作用小的天然药物是目前迫切需要解决的问题。桑葚(Mori Fructus)是植物桑(Morus alba L.)的成熟果实,收载于《中华人民共和国药典》(2015年版,一部),具有滋阴补肾、调节免疫等功效,被誉为“民间圣果”。本课题组前期研究发现粗多糖具有减轻肝损伤的作用。但是桑葚精多糖对肝保护作用的影响,其最佳构型和“构-效”关系还尚不明确,严重阻碍了对桑葚多糖的全面认识,不利于桑葚多糖在新药和功能性食品领域的发展。为解决上述问题,本课题以桑葚为原料,采用水提醇沉法得到桑葚粗多糖,再经过DEAE-52纤维素和Sephadex G-100凝胶柱层析进一步分离、纯化,最终获得三个相对均一的多糖组分(MFP-1、MFP-2和MFP-3)。然后对MFP-1、MFP-2和MFP-3进行氧化降解、硫酸酯化修饰和羧甲基化修饰,得到相应的修饰产物,并采用HPLC柱前衍生法和红外光谱法分析对桑葚多糖及其衍生物进行一级结构解析,同时评价了桑葚多糖及其衍生物对乙醇脱氢酶(ADH)活性的影响,初步筛选出具有保肝作用的桑葚多糖及其分子修饰法。最后,建立了急性酒精性肝损伤模型、刀豆蛋白A急性肝损伤和亚急性肝损伤模型,展开MFP-1及其羧甲基化衍生物对化学性肝损伤的保护作用研究。主要研究内容及结果如下:1.桑葚多糖的提取、分离、纯化。桑葚经匀浆、热水浸提、除杂等过程得到桑葚粗多糖。分别以蒸馏水、0.1、0.5 M NaCl溶液为洗脱液,将桑葚粗多糖通过DEAE-52纤维素柱层析分离,收集不同洗脱液洗脱组分,经透析和冷冻干燥得到桑葚粗多糖再经Sephadex G-100层析柱进一步纯化,最后得到三个多糖组分MFP-1、MFP-2和MFP-3,凝胶渗透色谱洗脱均呈单一峰形,提示为均一多糖。2.桑葚多糖的结构解析。通过化学法和仪器分析法对各多糖组分进行理化性质测定和结构表征,得到以下结果:(1)MFP-1分子量约为20.93 kDa,多糖含量达75.3%,硫酸基含量6.9%,糖醛酸含量为2.3%。MFP-1主要由Gal、Glc、Ara、Rha、Man等5种中性单糖组成,其摩尔比为26.8∶20.4∶8.7∶5∶1,MFP-1中主要,进一步说明MFP-1为中性多糖。(2)MFP-2分子量约为56.23 kDa,多糖含量达83.7%,硫酸基含量12.9%,糖醛酸含量为22.2%。MFP-2主要含有Ara、Gal、Rha、Glc、GalA,其摩尔比为34.2∶38.2∶8∶17.5∶15.1,在1636 cm~(-1)处出现宽吸收峰是-COO-非对称伸缩振,在1039 cm~(-1)处出现吸收峰是吡喃环的伸缩振动,可以推测这种多糖是吡喃环结构。(3)MFP-3分子量约为118.76 kDa,多糖含量达74.3%,硫酸基含量为1.8%,糖醛酸含量为61.7%。MFP-3主要含有Glc、Gal、Rha、GalA、Ara、GlcA,其摩尔比为47.4∶34.9∶36.1∶33.1∶19.9∶4.1,红外分析显示MFP-3在897 cm~(-1)处出现吸收峰,推测这种多糖含β-糖苷键。另外,三种多糖含有少量蛋白质和核酸,并遇碘液均不变色,说明均不含连续α-(1→4)Glc键型。3.桑葚多糖的化学修饰。采用氧化降解法、硫酸酯化修饰法和羧甲基化修饰法对桑葚多糖(MFP-1、MFP-2和MFP-3)进行分子修饰,共计得到9个修饰产物分别为:氧化降解产物(O-MFP-1、O-MFP-2和O-MFP-3)、硫酸酯化修饰产物(S-MFP-1、S-MFP-2和S-MFP-3)和羧甲基化修饰产物(C-MFP-1、C-MFP-2和C-MFP-3)。并测定各多糖的分子量、取代度(DS)和红外光谱。结果表明,多糖氧化降解后,MFP-1分子量由20930 Da降到7460 Da,得率为30.4%;MFP-2分子量由51230 Da降到30310 Da,得率为17.7%;MFP-3分子量由118760 Da降到4189 Da,得率为21.3%,说明三种多糖均得到一定程度的降解。经硫酸修饰后,MFP-1、MFP-2和MFP-3的DS的取代度分别为0.64、0.39和0.55,得率分别为45.9%、33.4%和52.1%。经羧甲基化修饰后,MFP-1、MFP-2和MFP-3的DS分别为0.71、0.46和0.21,得率依次为74.2%、68.7%和73.6%。三种方法得率依次为:羧甲基化修饰硫酸化修饰氧化降解。经红外光谱分析:9种多糖衍生物均在3440 cm~(-1)和2927 cm~(-1)附近出现由-OH伸缩振动和C-H伸缩振动的吸收峰,这是多糖的特征吸收峰,说明修饰后的样品保留了多糖的结构,硫酸酯化衍生物(S-MFP-1、S-MFP-2和S-MFP-3)在820 cm~(-1)附近出现吸收峰,说明多糖已被部分酯化。羧甲基化衍生物(C-MFP-1、C-MFP-2和C-MFP-3)多糖在1617 cm~(-1)和1423 cm~(-1)处出现新的吸峰,说明多糖已被部分羧甲基化。值得注意的是,C-MFP-1在848.21 cm~(-1)处出现新的吸收峰,848 cm~(-1)是吡喃糖的α型C-H振动的特征吸收峰。说明C-MFP-1可能含有α型吡喃糖。4.桑葚多糖及其衍生物对ADH活性影响的研究。本研究以ADH激活率为指标,建立体外ADH活性评价模型,分别测定修饰前后的桑葚多糖对ADH活性的影响。计算分析结果显示,修饰前后的桑葚多糖对ADH均有一定程度地激活作用,其中C-MFP-1(6.59±0.030 mg·mL~(-1))表现出对ADH有较高的激活能力,这可能与多糖的结构稳定性有关,也可能与C-MFP-1中存在的α型吡喃糖有关。5.为进一步研究桑葚多糖对化学性肝损伤的保护作用及潜在机制,开展了桑葚多糖及其羧甲基化衍生物对化学性肝损伤的作用研究。首先建立小鼠急性酒精性肝损伤、刀豆蛋白A急性肝损伤和亚急性酒精性肝损伤模型,综合MFP-1和C-MFP-1对血清中AST、ALT、LDH、TG、LDL-C、T-CHO、TBIL和肝脏中MDA、SOD、GSH-PX肝功能指标的检测以及病理切片的观察,多角度、多层面分析桑葚多糖及其羧甲基化衍生物(MFP-1和C-MFP-1)对化学性肝损伤的作用。结果表明,MFP-1和C-MFP-1对化学性肝损伤都有一定的效果,其中预先服用C-MFP-1组与模型对照组对酒精性肝损伤模型的各生化指标存在显著性差异。推测桑葚多糖及其羧甲基化衍生物抗化学性肝损伤的主要作用机制可能为,通过降低血清AST、ALT、TG代谢,提高机体对酒精代谢所产生的活性氧自由基的清除能力;通过抑制肝脏中MDA生成,增加肝脏中SOD和GSH-PX含量,减少由酒精产生的脂质物质,抑制脂质过氧化。
【图文】：
技术路线图
图 2-8 MFP-1，2 和 3 分子量的 HPLC 色谱图Fig.2-8 Mecular weight of MFP-1, MFP-2 and MFP-3糖的单糖组成分析
【学位授予单位】：贵州师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TS201.4;O629.12
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2708557
