新型电化学发光体系的构建及其在生化分析中的应用

发布时间：2020-06-13 07:58

【摘要】：在大健康时代的背景下,人们对食品安全、环境保护和医疗健康等产业有了新的要求和期待。高灵敏度、高通量、普适性强以及通用性广的分析方法的构建和微型化、便携式的检测装置的开发显得尤为迫切。电化学发光(ECL)技术的迅猛发展为此提供了有力的技术支撑。电化学发光是电化学与化学发光相结合的产物,集成了电化学分析速度快、时空可控性强及化学发光检测灵敏度高、线性范围宽等优点。从电化学发光现象的发现到发光机制的不断完善,从分子发光体的出现到纳米发光体的兴起,电化学发光的研究范围不断扩大,研究对象日益丰富,新材料、新体系更是层出不穷。如今,电化学发光技术已经在临床诊断、食品安全、环境监测等领域发挥重要作用。得益于其强大的交叉融合能力,电化学发光历经百年而不衰。今后,也将顺应时代潮流,并随着微型化、便携式终端检测设备的普及,走进千家万户。本论文以电极界面修饰和新型发光探针的制备为出发点,围绕电化学发光传感分析中涉及到的灵敏度、稳定性、选择性、分析通量等基础性科学问题展开。首先介绍了电化学发光的基本概念及其技术特点,并对其发展历史作了简要回顾;随后,总结了几种不同类型的电化学发光体及共反应剂,并着重介绍了湮灭型及共反应剂型电化学发光机理等。最后,系统综述了电化学发光在分析化学领域的应用,由此提出本论文的选题和研究思路。论文结合微芯片加工技术,在导电玻璃基底上制备了 T型氧化铟锡(ITO)双极电极。利用电化学辅助自组装法在双极电极表面修饰了一层二氧化硅介孔通道薄膜(SMCs)。该薄膜具有孔道垂直且高度有序,孔径超小且均一(2-3nm),孔隙率极高(4.0× 10~12pores/cm~2)等特点。基于电荷选择性,该薄膜对正电荷发光探针三(2,2'-联吡啶)钌(Ⅱ)(Ru(bpy)32+)的电化学发光强度实现了两个数量级的增强。基于该薄膜的超小孔道的尺寸筛滤作用及抗生物污染能力,实现了人血清中阿托品和L-脯氨酸等小分子胺类化合物的高灵敏电化学发光成像分析。合成了一种乙烯基功能化的二(2,2'-联吡啶)(4,4'-二乙烯基苯基-2,2'-联吡啶)钌(Ⅱ)(Ru(bpy)2(dvbpy)~(2+)),利用搭建的ECLspooling分析系统,获取时间分辨电化学发光谱图。通过光诱导巯基-烯烃“点击反应”将其共价接枝在(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS)预修饰的ITO电极上,制备了单分子层联吡啶钌修饰的固态电化学发光传感器(solid-state ECL)。以Ru(bpy)3~(2+)和三(2-苯基吡啶)合铱(Ⅲ)(Ir(ppy)_3)为出发点,通过配体修饰等策略,合成了几种不同类型的金属配合物:二(2,2'-联吡啶)(4,4'-二乙烯基苯基-2,2'-联吡啶)钌(Ⅱ)(Ru(bpy)2(dvbpy)~(2+))、二(2-苯基吡啶)(4,4'-二乙烯基苯基-2,2'-联吡啶)铱(Ⅲ)(Ir(ppy)2(dvbpy)~+)、二(2-苯基吡啶)(4,4'-二叔丁基-2,2' 联吡啶)铱(Ⅲ)(Ir(ppy)2(dtbbpy)~+)和二(2-(2,4-二氟苯基)-5-三氟甲基吡啶)(4,4'-二叔丁基-2,2'-联吡啶)铱(Ⅲ)(Ir(dFCF3ppy)2(dtbbpy)~+)。此六种探针的电化学发光波长在491nm到636 rnm范围内彼此可分辨。利用搭建的多维度电化学发光分析平台,从发光光谱、强度、图像等多个角度研究了红光探针Ru(bpy)_2(dvbpy)~(2+)、绿光探针Ir(ppy)_3和蓝光探针Ir(dFCF_3ppy)_2(dtbbpy)~+及其混合体系的电化学发光产生机制。通过多种手段观察到了Ir(ppy)3/TPrA体系在高电位下的电化学发光淬灭现象,并利用电化学-质谱联用技术对其淬灭机制进行了验证。得益于这种“开关效应”,它与任一探针混合均具有电位分辨能力。而红光探针与蓝光探针的电化学发光波长相差145 nm,能够实现光谱分辨。基于此,完成了红绿蓝三色体系的电位、光谱双分辨电化学发光。最后,将此三色探针分子负载到聚苯乙烯小球中,使用抗体对其编码,实现了甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)和人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)三种疾病标志物的同时检出。最后,对以上三个工作进行了总结,并展望了电化学发光的发展趋势。
【图文】：

电化学发光,共反应剂,机理

１．４．１湮灭型电化学发光机理逡逑大部分的湮灭型电化学发光都是在有机溶剂或者混合溶液中进行的。以稠环芳逡逑烃为例，图１．６ａ描述了湮灭型电化学发光产生的过程。在电极表面施加双阶跃正负逡逑脉冲电位时，Ａ在电极表面发生电化学还原生成阴离子自由基ＡＴ邋（式１．１），Ｄ在电逡逑极表面发生电化学氧化生成阳离子自由基Ｄ＋？（式１．２），电生中间体在电极表面附近逡逑经过高能电子转移反应形成激发态Ａ’（式１．３），激发态跃迁回基态，产生光辐射（式逡逑１．４）【２］。逡逑Ａ＋ｅ＂＾Ａ￣＊逦（式逦１．１）逡逑Ｄ－ｅ－＾Ｄ＾逦（式逦１．２）逡逑Ａ￣＊＋Ｄ＋＊－＾Ａ＊＋Ｄ逦（式逦１．３）逡逑Ａ＊邋—＞Ａ邋＋邋ｈｖ逦（式逦１．４）逡逑给定的湮灭反应焓变与第一激发单重态￡ｓ或第一激发三重态五Ｔ的光逡逑谱能级的相对大小决定了式１．３中的激发态激发单重态１或以激发三重态３Ａ‘逡逑的形式存在。逡逑激发态光谱能级￡ｓ或五ｔ邋（ｅＶ）可由式１．５得到，逡逑Ｅｓｏｒｒ邋（ｅＶ）邋＝邋ｈｏ＝ｈｃ／Ｌ邋＝邋１２３９＾邋＾逦（式逦Ｌ５）逡逑其中，／？表示普朗克常数，６．６２ｘｌ0－３４Ｊｓ；邋？表示光波频率；ｃ表示光速，３．0ｘｌ0８ｍ逡逑ｓ＿１；邋Ａ表示光的波长（ｎｍ）。逡逑湮灭反应焓变（－Ａ／／０）与化学反应（式１．３）的吉布斯自由能变（－ＡＧ０）有如下逡逑关系，逡逑－ＡＨ０＝－ＡＧｒ－ＴＡＳ°逦（式逦１．６）逡逑其中，，７ＡＳ—般估算为０．１ｅＶ（２９８Ｋ）。吉布斯自由能变化量（－ＡＧ°）可由氧化还原逡逑电对Ａ／Ａ－和Ｄ＋７Ｄ的标准电极电位得到

电化学发光,光成像,聚苯乙烯微球,电化学

固载的Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的电化学发光机理研究提供了更为直观的证据。当ＴＰｒＡ作为共反逡逑应剂时，由于电生中间体ＴＰｒＡ＋？的扩散，可以观察到整个ＰＳ微球（直径３｜ａｍ）的逡逑电化学发光，且在ＴＰｒＡ＋？等中间体浓度高的微区发光信号更强（图１．７ａ）。当采用直逡逑径为１２｜ｉｍ的ＰＳ微球成像时，施加１．１邋Ｖ的氧化电位，仅在距电极表面（ｚ轴方向）逡逑３邋－邋４邋ｐｍ的区域内可以观察到明显的电化学发光图像；距离电极表面较远的发光区逡逑域是由于ＰＳ微球透光，并能将底部发光会聚到顶部而产生的，并非直接来源于逡逑Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的电化学发光。这也说明了由于ＴＰｒＡ＋？的扩散距离有限，不能使距离电极逡逑表面更远的发光分子进行电化学发光反应（图１．７ｂ）。当采用ＤＢＡＥ作为共反应剂逡逑时，由于其自由基中间体ＤＢＡＥ＋？不稳定（寿命仅为ＴＰｒＡ＋？的十分之一），导致扩散逡逑距离变短，无法观察到ＰＳ微球表面Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的电化学发光。虽然在溶液相中逡逑Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋／ＤＢＡＥ体系的电化学发光发光效率更高，但对于Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋标记微球的生逡逑化分析
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O657.1

【参考文献】