磁颗粒复合分子印迹对蛋白质的分离纯化研究

发布时间：2020-06-23 13:54

【摘要】：本研究将磁性纳米颗粒与分子印迹技术相结合,开发一种蛋白质快速高效分离纯化新方法,为复杂体系中蛋白质的快速高效分离纯化提供一种新思路。本研究制备了硅氧基(O-Si-O)和羧基(-COOH)等基团修饰的磁纳米颗粒Fe_3O_4@SiO_2-AA,以牛血红蛋白(bovine hemoglobin,BHb)作为模板在磁颗粒上进行分子印迹反应,成功制备了分子印迹磁性纳米颗粒(magnetic molecularly imprinted nanoparticles,MIP),对MIP进行表征,并对其对蛋白质的吸附分离和洗脱性质进行了研究,具体研究内容如下:首先,利用化学沉淀法制备Fe_3O_4纳米颗粒,对Fe_3O_4纳米颗粒进行O-Si-O和-COOH等基团的修饰得到Fe_3O_4@SiO_2-AA颗粒。选择甲基丙烯酸(methylacrylic acid,MAA)和衣康酸(itaconic acid,IA)作为功能单体,N’N-亚甲基双丙烯酰胺(N’N-methylene bis acrylamide,N’N-MBA)作为交联剂,利用分子印迹技术制备MIP颗粒。研究发现当采用0.3%Fe_3O_4@SiO_2-AA颗粒,0.35%甲基丙烯酸,0.125%衣康酸和0.08%的N’N-MBA进行分子印迹时,所得到的MIP颗粒具有最优的BHb分子吸附量。其次,对所得磁颗粒进行了表征。利用傅里叶红外光谱分析发现O-Si-O和-COOH基团以及分子印迹聚合层成功地修饰在磁颗粒表面。透射电子显微镜表征发现MIP颗粒的粒径大致在20 nm左右,具有良好的分散性。通过热重分析发现MIP颗粒的磁含量约为84%,分子印迹层稳定性好。元素分析结果显示MIP的C含量为4.06%,MIP颗粒中模板蛋白BHb分子已完全洗脱。Zeta电位分析显示MIP的等电点为pH 4.5左右,也说明了所需基团和分子印迹聚合物的成功修饰。再次,本论文研究了不同环境条件对MIP吸附BHb过程的影响,并探究了其吸附机理。吸附动力学研究发现吸附12 h时,MIP颗粒对BHb的吸附达到平衡,获得了最大吸附量116.69 mg/g颗粒,吸附过程符合拟二级动力学模型。等温吸附研究得出吸附过程中BHb的最佳初始浓度为1.0 mg/m L,并且吸附过程符合Langmuir等温吸附模型描述的单分子层吸附。由不同溶液条件下MIP颗粒对BHb吸附量的研究可知,在pH 6.2时,由于静电吸引作用,MIP颗粒的吸附量可以达到169.29 mg/g颗粒。在NaCl浓度较低时,由于低浓度盐溶液对蛋白质的结构稳定作用,MIP颗粒对BHb的吸附量较大,而在高浓度NaCl溶液中,由于电荷屏蔽及蛋白质结构的变化,MIP颗粒对BHb的吸附受到抑制。在不同浓度尿素溶液中的吸附结果显示,MIP颗粒与BHb之间的氢键作用对其吸附效果具有一定程度的贡献。在SDS(sodium dodecyl sulfate)溶液和高浓度的尿素溶液中,蛋白质空间结构的改变使MIP对其吸附作用大大减弱。由MIP对BHb的选择性和竞争性吸附可以发现,MIP颗粒仅对模板蛋白有特异性的吸附作用,对其他蛋白质的吸附作用较弱。此外,本论文研究了不同洗脱液对MIP颗粒上BHb的洗脱效果,结果发现去离子水对BHb具有较高的洗脱率(64.23%),而以不同浓度NaCl溶液、不同pH值的PBS溶液、不同浓度的尿素溶液作为洗脱液对BHb的洗脱率均小于去离子水。用SDS溶液作为洗脱液结果显示,当SDS的浓度达到1%以上时,其对MIP颗粒上BHb分子的洗脱率十分接近100%。对不同洗脱液的洗脱得到的蛋白质结构分析得,去离子水、NaCl洗脱液、PBS洗脱液洗脱得到的BHb分子结构保持良好,不易发生变性,而高浓度的尿素溶液以及SDS溶液洗脱得到的BHb结构发生了变化。最后,在经过5次重复吸附洗脱实验后,MIP颗粒对BHb分子的吸附量仍可以达到110 mg/g以上,颗粒具有良好的材料稳定性和重复使用性。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ936;O631.3
【图文】：

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具有固定三维结构和确定排列功能团的空穴，并且这些空穴与模板60]。根据模板分子与功能单体之间的作用力种类可以将 MIT 分为印迹、半共价分子印迹、非共价分子印迹以及金属络合分子印迹。预定性、特异识别性和广泛实用性等三大特点，使得 MIT 逐渐成学、医学、环境科学、工业催化等领域交叉的新兴技术。MIT 已经在、模拟酶以及生物传感器等方面显示出巨大的应用前景[61]。印迹技术包含了三个主要环节，如图 1-1 所示：选择目标分子作为分子印迹的模板分子，选取合适的一种或多种须含有可以与模板分子适配结合的功能基团，选取可以结合功能单交联剂，选择合适的引发剂用于引发聚合反应。将模板分子与功能单体混合使其通过共价键或非共价键结合进行剂和引发剂引发聚合反应，形成呈网络状的分子印迹聚合物。使用合适的洗脱液将模板分子从分子印迹聚合物上洗脱下来，在成具有一定大小、形状和特定功能基团排列的孔穴，用于后续对模或吸附[62, 63]。

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3 结果与讨论3.1 分子印迹磁性纳米颗粒的制备MIP 的制备过程如图 3-1 所示。采用化学共沉淀法在高转速搅拌下制备出的 Fe3O4磁性纳米颗粒具有粒径小、比表面积大等特点，然而，由于其具有极强的超顺磁性，彼此之间极易聚集。加入 TEOS 为磁颗粒表面引入 O-Si-O 基团，保护了 Fe3O4颗粒，使其彼此之间不易团聚，同时，避免了 Fe3O4颗粒表面被氧化。丙烯酸（AA）的加入，制备得到了 Fe3O4@SiO2-AA 颗粒，为 Fe3O4磁颗粒表面引入乙烯基和羧基，增加了磁颗粒表面的活性基团，为后续反应提供了结合位点[103]。加入 BHb 进行预组装时，BHb 表面的-OH、-COOH 和-NH2等活性基团与 Fe3O4@SiO2-AA 颗粒表面的-OH 和-COOH 形成氢键结合，暂时固定于颗粒表面。而功能单体甲基丙烯酸和衣康酸以及交联剂 N’N-MBA的加入，与 Fe3O4@SiO2-AA 颗粒表面的不饱和基团发生聚合反应，在磁颗粒表面形成了分子印迹聚合层。用洗脱液将聚合层中的 BHb 洗脱干净后，分子印迹聚合颗粒表面便得到了许多三维形状、大小以及功能基团均与模板蛋白 BHb 相匹配的孔穴。

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