动物组织中MQCA和QCA残留发光免疫技术研究

发布时间：2020-07-04 00:08

【摘要】：喹乙醇和卡巴氧是喹VA琳药物的重要成员,可以抗菌和提高瘦肉率,常用于水产品和猪等饲料添加剂,在动物体内对应代谢产物为3-甲基-喹VA啉-2-羧酸(3-methylquinoxaline-2-carboxylic acid,MQCA)和喹VA啉-2-羧酸(quinoxaline-2-carboxylic acid,QCA)。MQCA和QCA具有致癌、致畸和致突变,同时对人体长寿细胞具有毒害作用,对食品安全造成威胁,需要建立灵敏和有效的检测方法监控食品中MQCA和QCA含量。本研究旨在建立灵敏和快速的同时检测MQCA和QCA的化学发光竞争间接酶联免疫方法(chemiluminescent competitive indirect enzyme-linked immunosorbent assay,CL-ciELISA)和背景荧光定量胶体金免疫层析方法(background fluorescence quenching immunochromatographic assay,bFQICA),同时利用免疫磁珠对样本中待测药物进行提取和富集,为动物组织中MQCA和QCA的残留检测提供技术支持。本研究化学合成半抗原MQCA-NH_2,与载体蛋白BSA(bovine serum albumin,BSA)和KLH(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联制备免疫原MQCA-NH_2-BSA和MQCA-NH_2-KLH,与载体蛋白OVA(ovalbumin,OVA)偶联制备包被原MQCA-NH_2-OVA。通过单克隆抗体制备技术制备MQCA抗体,经蛋白A亲和层析柱纯化后抗体的浓度为4 mg/mL,经测定抗体的IC_(50)(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))为0.20μg/L,与QCA交叉反应率为40%。建立基于免疫磁珠提取和富集同时检测动物组织中MQCA和QCA的CL-ciELISA检测方法,MQCA标准曲线IC_(50)为0.020μg/L,线性范围为0.008-1.00μg/L,与QCA药物的交叉反应率为40%。1 mg链霉亲和素磁珠和30μg生物素化MQCA抗体偶联制备免疫磁珠;鱼肉、虾肉、鸡肉和猪肉(2 g)均质后加入2 mLPBS提取,取800μL样本提取液加入0.3 mg免疫磁珠室温下孵育10 min,磁场作用下与样本基质分离;85℃加热洗脱5 min,洗脱液为100μLPBS;样本处理耗时30 min,MQCA和QCA药物浓缩4倍。鱼肉、虾肉、猪肉和鸡肉样本中MQCA的检测限分别为0.050、0.043、0.048、0.053μg/kg,QCA的检测限分别为0.090、0.100、0.130、0.180μg/kg。以0.5-2.0μg/kg(MQCA)和1.25-5.0μg/kg(QCA)的浓度添加样本,回收为77.0-117.0%,变异系数为4.5-11.5%,40份实际样本检测值与LC-MS/MS检测结果吻合度较高,表明基于免疫磁珠提取和富集的CL-ciELISA能同时检测动物组织中MQCA和QCA。建立基于免疫磁珠提取和富集同时检测动物组织中MQCA和QCA的bFQICA,MQCA标准曲线的IC_(50)为0.34μg/L,与QCA交叉反应率为40%。鱼肉、虾肉、猪肉和鸡肉中MQCA的检测限分别为0.35、0.40、0.45、0.40μg/kg,QCA的检测限为0.85、1.10、1.20、1.00μg/kg。以0.50、1.00、2.00μg/kg三个梯度添加MQCA和以1.25、2.50、5.00μg/kg三个梯度添加QCA,回收率为72.0%-118.0%,变异系数为5.2%-11.5%。40份实际样本的检测值与LC-MS/MS的相关性较好。bFQICA相比传统胶体金,可以进行灵敏的定量检测;与传统ELISA定量方法比较,bFQICA可进行现场检测。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O657.3;TS207.5
【图文】：

食品动物,喹乙醇,化学结构式,卡巴氧

图 1-2 MQCA 和 QCA 的化学结构式Figure 1-2 Chemical structures of MQCA and QCA我国农业部规定：2018 年起，禁止喹乙醇用于食品动物[11]。世界卫生组织和世界粮农织规定猪肝和猪肌肉组织中 MQCA 的最高残留限量为 20 和 4 μg/kg[21]，猪肝和猪肌肉组织QCA 的最高残留限量为 30 和 5 μg/kg[22]。喹乙醇和卡巴氧代谢物残留检测方法喹乙醇和卡巴氧代谢物残留仪器检测方法在兽药残留检测领域，已经有较多的方法检测在动物组织中 MQCA 和 QCA 的残留，器检测方法是公认的最可靠地的检测方法，具有灵敏度高、特异性好、精确度高和假阳性低等特点，包括液相色谱-质谱联用技术，高效液相色谱-质谱联用技术等，表 1-1 汇总了部喹VA琳类药物代谢残留的仪器检测方法。.2.4.2.4.1

动物组织中MQCA和QCA残留发光免疫技术研究

免疫原和包被抗原的合成路线图

【参考文献】