菊酯类农药广谱型免疫层析试纸条的研究及应用

发布时间：2020-07-08 10:25

【摘要】：建立了菊酯类农药广谱型免疫层析检测方法,可同时检测水果、蔬菜中12种甲氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯农药残留。以粒径20 nm的胶体金标记羊抗小鼠IgG抗体于金标垫上,分别固定包被原(检测线,T线)、兔抗山羊IgG抗体(质控线,C线)于硝酸纤维素膜(NC膜)上,与吸水垫及聚氯乙烯(PVC)底板组合成层析试纸条。10 g样品经乙腈提取,PBS稀释4倍,取100μL与菊酯类农药的单克隆抗体混合后,直接用于试纸条检测。结果表明,试纸条对甲氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯农药的裸眼观察检测灵敏度为0.5,5.0,5.0和5.0μg/mL,检测时长为8~10 min,采用QuEChERS方法,方法检测灵敏度可提高16倍。对蔬菜和水果的方法验证表明,除辣椒基质干扰呈假阳性外,其它样本的检测结果均与GC方法结果一致。试纸条采用金标羊抗小鼠IgG二抗的方法,使检测结果的重现性更好、更稳定,且抗基质干扰能力强,为菊酯类农药的累积毒性检测提供了新方法。
【图文】：

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图1胶体金免疫层析试纸条的组装示意图(1．PVC底板，2．NC膜，3．金标结合垫，4．吸水垫，5．检测线(T线)，6．质控线(C线)，7．样品垫)Fig．1Cross-sectionofimmunochromatographicstrip(1．polyvinylchloride(PVC)backing，2．nitrocellulose(NC)membrane，3．conjugatepad，4．absorbentpad，5．testline，6．controlline，7．samplepad)抗体形成的复合物在T线上沉积，形成肉眼可见的红色，过量的金标二抗及其与单克隆抗体形成的复合物继续向上迁移，与C线上的兔抗山羊抗体结合，形成肉眼可见的红色。当检测线颜色等于或深于质控线，结果判断为阴性。(2)当待检样品含有大于或等于该试纸最低检出限的菊酯农药时，样品液中农药与单克隆抗体特异性结合，阻止了其与T线上包被原的结合，使得单克隆抗体与金标羊抗鼠二抗形成的复合物无法在T线上形成沉淀，样品中菊酯含量越高，检测线颜色越浅至无色，胶体金标记的抗体及其复合物继续向上迁移到质控线，与C线上的兔抗山羊抗体结合，形成肉眼可见的红色。此时T线颜色变淡(浅于C线颜色)或接近无色，结果判断为阳性。(3)当C线没有颜色时，无论T线是否有图2免疫层析试纸条检测结果判定示意图Fig．2Schematicdiagramofimmunochromatographicstripstest颜色，均视为无效结果。检测时长8～10min，结果判断如图2所示。2．4样品提取与前处理2．4．1有机溶剂选择取10g切碎的蔬菜、水果样品(洋葱、葱、生姜、大蒜、韭菜、小青菜、辣椒、胡萝卜、番茄、黄瓜、苹果、西瓜、大白菜)到50mL玻璃瓶中，加入标样使添加浓度分别为0，2和4μg/mg(每个浓度做3个重复)，静置30min后，加入10mL甲醇/乙腈/丙酮/20%甲醇-PBS溶液，振荡30min，过滤，取1mL滤液用PBS溶液稀释4倍，用于试纸条检测。另取1mL滤液，氮气吹干后，以

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蚩固褰岷希嚯纬扇庋劭杉鉨暮焐郶５奔觳庀哐丈鄏扔诨蛏钣?质控线，结果判断为阴性。(2)当待检样品含有大于或等于该试纸最低检出限的菊酯农药时，样品液中农药与单克隆抗体特异性结合，阻止了其与T线上包被原的结合，使得单克隆抗体与金标羊抗鼠二抗形成的复合物无法在T线上形成沉淀，样品中菊酯含量越高，检测线颜色越浅至无色，胶体金标记的抗体及其复合物继续向上迁移到质控线，与C线上的兔抗山羊抗体结合，形成肉眼可见的红色。此时T线颜色变淡(浅于C线颜色)或接近无色，结果判断为阳性。(3)当C线没有颜色时，无论T线是否有图2免疫层析试纸条检测结果判定示意图Fig．2Schematicdiagramofimmunochromatographicstripstest颜色，均视为无效结果。检测时长8～10min，结果判断如图2所示。2．4样品提取与前处理2．4．1有机溶剂选择取10g切碎的蔬菜、水果样品(洋葱、葱、生姜、大蒜、韭菜、小青菜、辣椒、胡萝卜、番茄、黄瓜、苹果、西瓜、大白菜)到50mL玻璃瓶中，加入标样使添加浓度分别为0，2和4μg/mg(每个浓度做3个重复)，静置30min后，加入10mL甲醇/乙腈/丙酮/20%甲醇-PBS溶液，振荡30min，过滤，取1mL滤液用PBS溶液稀释4倍，用于试纸条检测。另取1mL滤液，氮气吹干后，以正己烷定容，用于GC检测［23］。2．4．2简化QuEChEＲS方法［24］取5g切碎样品至50mL离心管中，加入5mL乙腈涡旋震振荡提取3min后，4000r/min离心5min，取上清液2mL于40℃水浴氮气吹干，用20%甲醇-PBS溶液0．5mL复溶提取物，用于试纸条检测。3结果与分析3．1胶体金和胶体金标记抗体扫描图谱用紫外分光光度计对所制备的胶体金进行波长扫描，从图3a可见，胶体金溶液的最大吸收波长λmax=520nm，吸光度为0．9556;透射电镜观察胶体金颗粒，粒径均一性较?

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图3胶体金溶液扫描图谱(a)，胶体金的透射电镜图(b)Fig．3Visiblespectrumofcolloidalgold(a)，TEMimageofcolloidalgold(b)4μL时，离心管内颜色呈红色，随着抗体量加大，管内颜色未有明显变化，因此，羊抗小鼠二抗的最小标记浓度为4μg/mL。根据最小标记浓度，选择3．5，4．0，4．5，5，5．5和6．0μg/mL标记浓度对胶体金进行标记，将T线上出现肉眼可见的且颜色较红的标记浓度确认为抗体的最佳标记浓度。当抗体标记浓度＜4μg/mL时，T线颜色较浅;抗体标记浓度为5μg/mL时，T线颜色出现较为明显的红色条带。因此，5μg/mL作为抗体最佳标记量。3．3菊酯类农药单克隆抗体加入量优化分别在100μL20%甲醇-PBS的缓冲液中加入0．3，0．5，0．8，1．0和1．5μL的菊酯类农药单克隆抗体(1．0mg/mL)，10min后观察T线颜色深浅。当单加入0．3μL克隆抗体时，T线颜色较浅;加入0．5μL克隆抗体时，T线显色清晰;随着单克隆抗体浓度量的加大及时间的延长，T线颜色逐渐加深。所以，0．5μL为最佳单克隆抗体量。3．4免疫层析试纸条的检出限用20%甲醇-PBS配制系列梯度农药标准品，浓度为0，0．1，0．2，0．5和1．0μg/mL甲氰菊酯标准溶液，浓度为0，0．2，0．5，1．0，5，10和20μg/mL的氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯标准品溶液。分别取100μL，与适量的菊酯单克隆抗体预混后加入上样孔，10min后观察结果。随着菊酯农药浓度升高，T线区域红色逐渐变浅，C线区域红色无明显变化，在甲氰菊酯标准溶液浓度为0．5μg/mL时T线基本消失(图4)，氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯在浓度为5μg/mL时，试纸条T线基本消失(图5)。甲氰菊酯试纸条的检出限为0．5μg/mL，可满足国家标准中对应水果、蔬菜中农药最大残留限量的要求(0．5～5．0mg/kg，GB2763-2014)，氯氰菊酯、三氟氯氰菊

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