环境诱导丝素蛋白构象转变的红外光谱及丝素蛋白复合膜的研究

发布时间：2020-07-11 01:44

【摘要】：蛋白质的构象转变一直是科学中的基本问题。有关蚕丝及其丝蛋白的研究表明,丝纤维优异的力学性能与其构象有着密切的关系。β-折叠构象与丝纤维的强度有关,而α-螺旋和无规卷曲结构的含量与丝纤维的弹性有关。在一定的环境,如有机溶剂、温度、金属离子、pH值的变化及剪切力等条件诱导下,丝蛋白构象都会发生变化,因而研究丝素蛋白构象转变的过程有助于深入了解蚕丝优越的综合力学性能。二维相关光谱技术(2D-COS)已被广泛用于蛋白质构象转变的研究中。这些研究基本上都是利用了二维相关光谱技术的所谓两大优势:1)可提高光谱的分辨能力;2)可得出外扰因素下光谱信号变化的“序列顺序”。结果是,几乎所有运用二维相关光谱来进行蛋白质构象转变过程的研究,都会得出相似的结论,即蛋白构象转变不是一个协同的的过程,而是包含了序列顺序。但是,我们已有的理论研究和实验结果表明,通过二维相关光谱技术中的“序列顺序”规则得出的序列顺序结果并不具有普适性。同时,二维相关分析技术的第一个优势:提高光谱的分辨能力也具有很大的不确定性。针对上述问题,本论文以丝素蛋白为研究对象,结合原位红外光谱分析方法(二阶导数、傅里叶自去卷积、曲线拟合)和二维红外相关光谱技术,系统研究了丝素蛋白二级结构在不同环境扰动下的转变过程,希望解决一个基本的科学问题:环境扰动诱导的丝素蛋白二级结构或性质的变化过程是完全协同还是存在一定的序列顺序,以期完善广义二维相关光谱,并促进其在蛋白质科学及其他领域的合理使用。另外,基于化学因素诱导丝素蛋白构象转变的原理,我们拟通过调控丝素蛋白构象来调控丝素蛋白改性的聚乙烯醇复合膜的性能,从而为这一纯粹的基础研究找到应用背景。论文的具体安排与研究内容如下:1、温度诱导丝素蛋白构象转变的红外光谱研究我们首先获得了在温度区间130℃至220℃变温过程中丝素蛋白膜的原位红外光谱图。然后结合二维相关光谱、傅里叶自去卷积和二阶导数的分辨结果,利用曲线拟合技术对再生丝素蛋白在130-220℃升温过程中的二级结构变化情况进行分析,得到丝素蛋白中各二级结构对应的峰强度及其峰面积变化的具体信息。最后将原位光谱分析的结果与二维相关分析技术得到的“序列顺序”结果进行对比,发现,二维相关分析得出的丝素蛋白膜在130-220℃温度区间内的序列顺序(β-折叠(低波数,1630 cm~(-1))无规卷曲构象(1650 cm~(-1))非酰胺C=O(1720 cm~(-1))α-螺旋构象(1660 cm~(-1)))结论超乎常识,是值得怀疑的。而采用原位红外光谱分析得出的序列顺序结果表明,丝素蛋白主要的二级结构包括α-螺旋、β-转角、无规卷曲和β-折叠(高波数)在低温下几乎同时发生转变,而非酰胺C=O(1724 cm~(-1))和β-折叠(低波数,1629 cm~(-1))在高温下才开始发生转变。从原位红外谱图分析中我们还能看出在升温过程中,200℃之前丝蛋白的构象由α-螺旋和无归卷曲逐渐转变为β-转角、β-折叠和非酰胺C=O。200℃之后,部分β-转角构象被破坏,逐渐转变为β-折叠和非酰胺结构。另外,我们比较了不同状态下丝素蛋白在温度区间(30-80℃)内的构象转变,结果显示,水在丝素蛋白构象转变中起到重要作用。最后结合热重-红外联用仪、固体核磁共振和红外光谱对丝素蛋白的热降解行为进行了研究,丝素蛋白膜在高温处理时,会发生降解,生成CO_2和NH_3等小分子。丝素蛋白的构象由无规卷曲/α-螺旋结构转变为β-折叠构象。2、化学因素诱导丝素蛋白构象转变的红外光谱研究研究了醇类有机溶剂、不同pH值和不同钙离子含量三种化学因素诱导丝素蛋白构象的转变。1)甲醇、乙醇和不同含量乙醇诱导下丝素蛋白各二级结构同时发生转变,并不存在先后序列顺序。丝素蛋白在甲醇、乙醇和正丙醇诱导下二级结构都是由无规卷曲、α-螺旋和β-转角向β-折叠构象转变。丝素蛋白在三种醇溶剂中的转变速率为甲醇乙醇正丙醇,其中甲醇能够诱导丝素蛋白形成最快且最多量的β-折叠构象,正丙醇中丝素蛋白构象转变速率最慢。2)不同pH值诱导下丝素蛋白的构象同时发生转变,不存在先后序列顺序。丝素蛋白在不同pH值诱导下二级结构随pH升高时由β-折叠和β-转角逐渐转变为α-螺旋和无规卷曲构象,即弱酸性条件下更有利于β-折叠的生成,而弱碱性条件下更有利于α-螺旋和无规卷曲的稳定。3)基于1)中乙醇诱导的丝素蛋白分散体中加入不同量的钙离子,分散体由浑浊变得澄清。钙离子存在时,更有利于丝素蛋白各二级结构中α-螺旋和无规卷曲的形成,随着钙离子浓度的增加,β-折叠和β-转角构象逐渐转变为α-螺旋和无规卷曲构象。这一研究有助于理解氯化钙溶液能够溶解蚕丝制备再生丝素蛋白水溶液,从而制备一系列丝素蛋白基材料。3、压力诱导丝素蛋白构象转变的红外光谱研究采用时间分辨光谱技术研究了压力对丝素蛋白湿膜中丝素蛋白构象的影响。压力无法诱导丝素蛋白干膜发生构象的转变。但是当丝素蛋白膜中含有部分重水时,压力能够诱导丝素蛋白由无规卷曲、a-螺旋和β-转角构象向β-折叠结构转变;在恒定压力和恒定的重水含量下,丝素蛋白湿膜中丝蛋白构象转变随时间分辨的过程可以分为三个阶段。在初始阶段,无规卷曲、a-螺旋和β-转角构象转变为β-折叠构象;第二阶段,无规卷曲和β-转角构象转变为β-折叠(1618 cm~( 1))和a-螺旋(1647 cm~( 1),~5%);最后阶段,丝素蛋白各二级结构含量没有明显的变化,属于平衡阶段。4、丝素蛋白增强聚乙烯醇复合膜的制备及性能研究基于乙醇和酸性溶液诱导丝素蛋白构象转变的原理制备了丝素蛋白/聚乙烯醇交联复合膜,以期通过调控丝素蛋白构象来调控复合膜的性能。为减少丝素蛋白和聚乙烯醇之间的相分离,采用戊二醛作为二者的交联剂。比较了复合膜经过醇溶液和酸性溶液处理后丝素蛋白构象、复合膜的力学性能、相分离程度和最大热失重速率随温度的变化。戊二醛交联后的SF/PVA复合膜相分离程度明显较少,能够得到完整均匀的复合膜。乙醇溶液处理后的复合膜中,丝素蛋白分子链转变为β-折叠构象,使分子排布更加紧密,构象更加规整,从而更进一步地提高SF/PVA交联复合膜的力学性能。酸性溶液处理的复合膜中,丝素蛋白分子链也能重排形成部分β-折叠结构,但是相对含量远比乙醇诱导为β-折叠构象的含量低,因此,酸性溶液处理的复合膜的力学性能低于乙醇处理的SF/PVA交联复合膜。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O629.73
【图文】：

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图 1-1 一根桑蚕茧丝的 SEM 图像[20]Fig. 1-1 SEM image of a silkworm silk5 wt.%左右的杂质[17]，除了 C、O、H 和 N 等蛋白

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图 1-2 桑蚕腺体示意图[51]Fig. 1-2 Schematic diagram of mulberry silkworm gland前部；am—中部前区；amm—中部中区前端；p—丝腺中部后区；pmm—中部中区后端；F—鳞翅目动物的菲

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有科研工作者总结出蚕丝形成的机理[52]，如图1-3 所示，桑蚕吐丝的驱动力是由外部的拉力和腺体内部的推力共同作用的结果，由此对丝蛋白液在腺体的不同部位产生相对的剪切速率；在特定的剪切速率下，原本球状的丝蛋白分子链将会取向形成 β-折叠结构。图 1-3 桑蚕丝腺体和吐丝口的尺寸[52]Fig. 1-3 The mulberry silkworm gland and the size of spinning虽然上述的蚕吐丝机理给出了丝纤维形成的过程，但仍有许多细节在当时并不明确。比如分子量超过 350000 的蚕丝素蛋白纺丝液在丝腺体中部的浓度 25wt.%，但是其流动性却很好。后来人们发现在前部丝腺体中丝素蛋白以液晶态的形式存在[53,54]。这种方式能有效降低纺丝液在纺丝管中的黏度，从而能够使丝素蛋白分子在高浓度的纺丝液中完美取向，形成综合力学性能优异的丝纤维。丝素蛋白 GAGAGS 重复片段最初在腺体中的结构为 Silk I[55]。当纺丝液经过一段纺丝管时，纺丝管的内径会急剧减小，纺丝液发生拉伸流动，使丝素蛋白分子链构象发生重排并沿流动方向取向。然后丝素蛋白分子链进一步相互靠近并通过疏水作用和氢键作用相结合，转变成 Silk II（β-折叠）结构，水分子逐渐从丝纤维的表面排出。除此之外，pH 值在丝纤维的形成过程中也会发生变化。在蚕的腺体中，纺丝液沿着纺丝管 pH 值会逐渐下降[31]。研究?

【参考文献】