酿酒酵母表达ligD，ligF和ligG酶选择性断裂木质素β-O-4键的研究

发布时间：2020-07-13 12:17

【摘要】：物理化学方法降解处理木质素条件要求严苛,并且污染严重。传统的真菌降解木质素的选择性差,容易造成苯环的开裂,并且降解产物处于解聚和重新聚合之间的动态平衡。木质素单体连接键中含量最多的是β-O-4键,研究β-O-4键的选择性降解对有效获取木质素单体非常关键。本研究主要通过以酿酒酵母为底盘表达来源于鞘氨醇单胞杆菌的木质素β醚解酶,以愈创木酚基甘油β愈创木基醚(GGE)为模拟底物,研究选择性可控断裂木质素β-O-4键。通过胞内表达木质素β醚解酶,研究了辅因子对β-O-4底物降解的影响,同时对β醚作用条件进行优化,结果表明辅因子对二聚体有较显著的影响和酶作用的条件最优是50℃、pH为9.0、缓冲液Tris-HCl和Cu~(2+)。通过选用MFα信号肽和SED1信号肽将目标蛋白分泌细胞外,实现了培养上清液降解木质素模式底物二聚体。同时发现MFα信号肽介导的分泌降解34%二聚体强于SED1信号肽介导的降解28%二聚体。鉴于木质素β醚解酶由三个亚酶组成,研究分析将三个酶在一个细胞内分泌表达和分别在不同细胞内分泌表达的分泌效果,结果发现三个酶分别在三个细胞中分泌表达降解34%,效果优于同时在一个细胞内的分泌表达降解24%的效果。我们进一步研究了对分泌表达的三个酶的比例对降解效果的影响,发现三者的最优降解效果比例为ligD:ligF:ligG=2:1:5,实现27%的降解。我们研究了不同启动子,如PGK1p,TDH3p和Gal1p等对蛋白分泌的影响,发现Gal1p启动子作用下的酶分泌降解二聚体效果最优,达到0.376μmol,提升了34%。通过选用不同的温度和培养基对酿酒酵母培养条件进行优化以增强目标酶的产量和活性,结果表明温度为30℃,培养基为YPD时降解效果最优。
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O636.2;Q55
【图文】：

二聚体,漆酶,过氧化物酶,氧化体

图 1-1 木质素单体结构[13]Figure 1-1 Structure of lignin monomers木质素是通过植物源的过氧化物酶和漆酶作用形成的，木质素单体通过过氧化物酶和漆酶的作用形成自由基进而耦合成二聚体，随后形成的二聚体通过酶的继续作用形成单电子的氧化体，在此氧化后的二聚体上不断的延长碳链，最终形成了复杂的多分支的木质素结构，如 1-2。

木质素,形成机制,二聚体,漆酶

连接键,木质素,单体,类型

第一章文献概述醚键和 C C 键是木质素中主要连接键，其中醚键大约占据了 2/3 左右，而剩余的连接是碳碳键。为了将连接单体各种类型键进行分类，将单体上的碳原子进行编号，编号规则为：单体脂肪侧链的碳原子分别称为α（靠近苯环），β，和γ；芳香基团的碳原子则编号为 1-6。例如，一个β-O-4 连接键则代表着在脂肪侧链的β碳和芳香烃的 C4 位置的氧原子形成共价键。常见的连接键的连接方式如下图 1-3 所示。表 1-1 植物中各种连接键和功能基团的含量中是这些键在植物中的含量。

【参考文献】