基于光响应超分子开关构筑智能谷胱甘肽硫转移酶

发布时间：2020-08-10 16:49

【摘要】：酶的催化功能在生命活动过程中通常会受到反馈回路和各种触发诱导因素的严格控制。典型的,如含有LID结构域的酶,它可通过自身变构来实现催化功能的反复调控。这种调控借助可变结构域对催化位点的“开/关”效应,影响酶与底物分子的识别作用,进而可逆控制酶的催化性能。受此启发,大量含有偶氮苯、螺吡喃、二芳基乙烯等刺激响应基团的人工智能催化剂被开发出来,用以改变反应物或产物的化学、区域以及立体选择性,调节其催化反应进程,并通过研究其在生物医学领域的应用,模拟自然界酶生物功能的严格调控行为。因此,构筑具有类似天然酶可控性质的智能酶已经成为人们关注的热点领域。近年来研究表明,基于蛋白质骨架构筑的智能酶具备极高的催化性能,并展示出比天然酶更丰富的调控方式,因而具有较好的研究与应用价值。目前,智能酶的设计策略主要分为两类:(1)在天然别构蛋白中创建全新的酶催化中心,并利用蛋白骨架的别构效应使催化中心结构域发生构象重组,调控酶的催化与底物识别行为;(2)利用人工合成的刺激响应性小分子或高分子,通过定点修饰引入天然酶分子中,模拟LID的调节功能。但综合其构建难度和调控效果,两种方案均有一定的局限性:首先,在本无催化功能的别构蛋白骨架中从头设计全新的催化中心需要复杂的计算机设计,整体设计难度较大;其次,在酶骨架上引入调控基团,需要对其进行精准定位,修饰位点的选取十分困难;另外,利用修饰的刺激响应型高分子链调控酶活,其尺寸较大,难以避免对酶的活性造成影响。随着超分子化学研究的兴起,由于其尺寸合适,以及动态可逆的特点,非常适用于构建刺激响应型智能酶,且具有调控性能优异和操作简便的优势。这些智能超分子催化剂为天然酶与超分子开关的组合提供了研究基础,尤其是利用刺激响应型的主-客体大环超分子调控天然酶的催化活性,模仿天然LID结构域对酶的调节作用,可有效地结合天然酶的高效催化与超分子的调控优势,发展新的高性能酶学调控方法。在众多刺激响应超分子调控方式中,光响应调控可远程控制且响应迅速,清洁无残留,无疑是设计智能酶的最佳方式。因此,本论文借助环糊精(CD)和马来酰亚胺修饰的偶氮苯分子(Azo-MAM)之间的主客体相互作用成功地构建了一种光响应超分子开关,并通过将其选择性修饰于天然酶骨架中,测试了α-CD和β-CD在紫外光/可见光互变环境下对酶催化活性的开关效应。同时,我们也研究了不同CD分子的尺寸、修饰位点、及其与偶氮苯修饰酶的结合热力学参数对酶活性调控的影响,详细内容如下:1.光响应谷胱甘肽硫转移酶的构筑与开关效应谷胱甘肽硫转移酶(GST)是一种解毒酶,晶体结构显示其含有一个明显的底物结合疏水空腔,催化位点位于空腔底部,且周围有多种氨基酸通过非共价作用稳定底物谷胱甘肽(GSH)。基于GST的结构特点,首先对GST酶空腔附近的117和124位点分别进行定点突变,引入Cys残基作为拟修饰位点。同时,合成马来酰亚胺修饰的偶氮苯衍生物Azo-MAM作为客体分子,α-CD和β-CD分别作为主体分子,通过Cys与MAM之间的“Click”反应将两种主-客体复合超分子开关嵌入GST酶中:(1)仅在124位修饰trans-Azo-MAM-CD超分子开关;(2)同时在117和124位修饰trans-Azo-MAM-CD超分子开关。由于α-CD和β-CD对顺反两种构型的偶氮苯具有选择性,即可利用紫外/可见光触发GST表面Azo分子的顺反异构,调控CD与Azo解离和复合,进而控制GST底物结合空腔的“开启”与“关闭”,实现对GST酶催化活性的可逆调节。2.光响应谷胱甘肽硫转移酶开关性质的研究酶学测试α-CD和β-CD调控GST酶活性的性能。研究5个紫外/可见光循环后,单双位点修饰的GST酶Azo-MAM-GST/K124C和Azo-MAMGST/L117C/K124C的活性变化,计算两种超分子开关的对酶的关闭效率,研究其调控效果、响应时间和控制的稳定性。结合α-CD、β-CD和GST相对尺寸和对酶催化活性的可逆控制效果,详细分析超分子开关的空间大小对于调控效果的影响。此外,通过测定光控GST的二级反应速率常数、α-/β-CD与之结合的热力学常数、底物GSH与光控GST结合的热力学常数,从动力学和热力学两个角度验证该超分子开关控制酶催化反应速率的调控机理,该工作为单分子层面控制酶活提供了简单而有效的思路,并且实现了对于生化反应的有效调控。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O641.3;Q814

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