以甜菜碱类材料为配基的色谱固定相制备与应用研究

发布时间：2020-08-22 20:23

【摘要】：混合模式色谱(mixed-mode chromatography,MMC)法的发展,在复杂样品的分离分析方面弥补了单一模式色谱的固有缺点。其中,MMC固定相中色谱配基的选择成为了研究热点。两性离子类化合物作为一种具有仿生结构的材料,在蛋白质分离与分析、复性与同时纯化方面引起了研究者们的兴趣。因其独特的结构,该类材料作为色谱配基制备的固定相可提供多种作用力,表现出了明显优势。在以往的工作中,许多研究小组包括我们分别利用天然结构的磷酰胆碱(phosphorylcholine,PC)基团及其衍生物2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(2-methacryloyloxy ethylphosphorylcholine,MPC)作为色谱配基制备了两性离子交换色谱(zwitterionic ion chromatography,ZIC)、亲水相互作用色谱(hydrophilic interaction chromatography,HILIC)固定相以及HILIC/弱阳离子交换相互作用(weak cation exchange chromatography,WCX)的MMC固定相,在固定相应用于蛋白质和许多极性小分子分离中都表现出很好的分离性能。此外,对大肠杆菌高效表达的包涵体复性中也有明显优势。在本工作中,为了对两性离子类材料进行系统的研究,我们选用磺酸基甜菜碱(3-[N,N-dimethyl-N-(methacryloyloxyethyl)ammonium,SBMA)和羧基甜菜碱(carboxybetaine methacrylamide,CBMA)作为色谱配基,制备了同时具有离子交换色谱(ion exchange chromatography,IEC)、HILIC等不同高效液相色谱模式的MMC固定相。分别利用极性分子和蛋白质评价了不同配基色谱的固定相保留特征和分离性能,并将其应用于一类小分子和蛋白质分离,以及包涵体的复性与纯化研究,初步探讨其分离机制和应用。本论文包括以下四部分:1.文献综述近年来,MMC法被运用到生物医药的检测、分离与分析以及蛋白质制备等多个领域。MMC配基选择是固定相发展的关键和核心所在,本章节主要对MMC固定相材料发展及其应用做了综述,也对其机理进行了简要讨论。2.以磺酸基甜菜碱为配基的混合模式色谱固定相制备、表征及性能评价磺酸基甜菜碱是磺铵两性离子化合物的代表,具有带正电荷的季铵离子基团和带负电荷的磺酸基团,其表面在广泛p H范围内显示电负性,可提供亲水相互作用,同时也有离子交换作用。前者作为固定相配基时可以在亲水相互作用色谱实现对小分子(三聚氰胺、苯及其同系物)的分离。但是,由于在磺酸基甜菜碱中的磺酸基的离子交换作用力较弱,还未见报道。在本实验中,我们利用磺基甜菜碱为配基制备了硅胶基质的MMC固定相,简称SBMA-silica。首先,利用元素分析、傅里叶红外光谱、热重分析以及X射线光电子能谱表征SBMA-silica固定相的键合情况。结果显示,磺基甜菜碱成功地接枝于硅胶基质表面,元素分析计算其最佳配基密度为1.03μmol/m2,动态吸附量为49.6mg/g。然后,分别在HILIC和IEC模式下,用核苷、碱基混合物和标准蛋白评价该固定相分离性能和保留特征,考察含水量和流动相p H确认SBMA-silica符合HILIC和SCX的保留规律。3.以羧基甜菜碱为配基的混合模式色谱固定相制备、表征及性能评价为了同时研究甜菜碱类离子基团以及疏水作用对蛋白质分离的影响,选择两性离子化合物羧基甜菜碱作为固定相配基。羧基甜菜碱分子与甘氨酸化学结构相似,具有良好的生物相容性,可以通过结构中烷基链长度调节阴/阳离子间距,与磺基甜菜碱相比,含有阳离子和疏水作用基团。在本工作中,首先,核磁共振氢谱表征了合成的(6-羧基戊基)-3-丙烯酰胺基丙基二甲基铵甜菜碱单体(5-CBMA),然后以5-CBMA单体为配基制备了具有HILIC与IEC/HIC/RPLC的MMC固定相(5-CBMA-silica),并利用元素分析、红外光谱以及X射线光电子能谱(XPS)证实将CBMA成功地键合到硅胶基质表面,其键合密度为1.18μmol/m2,动态吸附量为42.1 mg/g。用核苷和蛋白质混合物评价色谱分离性能和保留特征,初步结果发现,在HILIC模式下可以实现对五种核苷的基线分离,具有经典HILIC保留特征。但是,在WAX模式、HIC模式以及RPLC模式下对蛋白分离的选择性较低,其保留能力较弱,有待于进一步的研究。4.以甜菜碱类材料为配基的混合模式色谱固定相对包涵体的复性与同时纯化蛋白质折叠液相色谱法(protein refolding by liquid chromatography,PFLC)是一种理想、有效和易于规模放大的蛋白质复性与纯化方法。但是,变性蛋白尤其是大肠杆菌高效表达的包涵体无活性、不溶于水,仅溶解于强的变性剂(如8M脲或6-7M盐酸胍)中,其疏水性很强在很多固定相不保留或者保留较弱,易于重新聚集并沉淀导致复性效率很低。一些研究包括我们的前期实验的结果发现,MMC固定相的多个基团有利于变性蛋白复性与同时纯化。因此,本工作中,我们分别利用制备的5-CBMA-silica、SBMA-silica对大肠杆菌中高效表达的重组人Notch配体Delta-like 1(h Dll1)包涵体进行复性与同时纯化的研究。结果显示,两种固定相在IEC模式下均能实现对rh Dll1包涵体复性与同时纯化,但是,用SBMA-silica复性与同时纯化的质量回收率(56.4%)CBMA-silica(34.6%)。当在流动相中添加浓度为4.0 mol/L脲时,SBMA-silica的质量回收率可达60.3%,目标蛋白纯度可达98.0%,更利于rh Dll1包涵体复性与同时纯化。利用圆二色谱对rh Dll1复性与同时纯化前后构象变化的测定结果显示,经一步色谱过程所获得的rh Dll1构象符合蛋白质二级结构(α-螺旋)特征。
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O652.6
【图文】：

色谱,文献综述,色谱性能,工作研究

第一章文献综述条件下研究这些固定相色谱性能和分离模式，并运用于多种色谱模式下实现对复杂的分离分析，同时根据多种相互作用提高包涵体的复性与同时纯化效率。本工作旨于以往研究工作，对两性离子作为色谱配基进行系统性地研究，为仿生功能色谱固的发展奠定一定的基础。本工作研究路线图如图 1-2 所示：

示意图,固定相,示意图,色谱固定相

第二章以磺酸基甜菜碱为配基的混合模式色谱固定相制备、表征及性能评价9 HILIC 模式下核苷保留模式测试考察改变洗脱梯度对核苷的保留影响。色谱条件同 2.3.8。结果与讨论1 SBMA-silica 色谱固定相的制备与表征SBMA 修饰的硅胶基质 MMC 固定相合成示意图见图 2-1。首先，将 MPTES 修饰到表面，制备出带有巯基的硅胶（Si-MPS）；然后利用“巯基-烯烃基”点击化学方法，BMA 接枝于巯基化硅胶表面制备出聚合物刷 MMC 固定相，简称为 SBMA-silica。

红外表征,固定相,硅烷偶联剂

A=1:1.5 7.251 0.727 1.699 A=1:1.1 6.944 0.717 1.399 A=1:1.05 5.085 0.616 1.089 A=1:1 5.003 0.536 1.065 A=1:0.96 3.273 0.404 1.032 次测定平均值所得外光谱（IR）对 SBMA-silica 表面官能团的化学组成胶表面被巯基化硅烷偶联剂修饰后，2922 和 2853cm这是硅烷偶联剂中的亚甲基对应的红外峰，巯基因特征峰，1748cm-1处为羰基的特征吸收峰，1343cm以确定 SBMA 已经键合到硅胶表面。

【参考文献】